الكشف عن<em> المثقبية البروسية</em> التبديل البديل البروتين السكري السطح بواسطة المغناطيسي خلية المنشط فرز والتدفق الخلوي
Summary
African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of “switched” variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.
Abstract
Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have ‘switched’ to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.
Introduction
وطفيلي، المثقبيات البروسية، هو العامل المسبب للأمراض التي تصيب الإنسان (عبر المثقبية البروسية الغامبية والمثقبية البروسية الروديسية) والحيوانات (عبر المثقبية البروسية البروسية) في جميع أنحاء أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى. وينتقل المرض إلى المضيف الثدييات عن طريق اللعاب من ناقلات ذبابة التسي تسي. كل من الإنسان وداء المثقبيات الأفريقي الحيوانية تسبب عبئا اقتصاديا كبيرا في المناطق الموبوءة، وقليلة الأدوية المتاحة أو في مجال التنمية لعلاج إما المرض. فهم آليات التهرب المناعة أمر بالغ الأهمية لتطوير عقاقير لداء المثقبيات. تباين الأنتيجين للكثيفة، سطح البديل البروتين السكري (VSG) معطف الذي يغطي الطفيلي هو إحدى الوسائل الرئيسية التي T. البروسية يتهرب استجابة الأجسام المضادة الثدييات. وجود ما يقرب من 2000 أنواع من الجينات VSG في الجينوم المثقية، ولكن كتب واحد فقط في أي وقت من الأوقات من أحد ~ 15 مورينداتاهيتيانونيمواقع سيون. "التبديل" من VSG أعرب يمكن أن يحدث إما عن طريق نسخ الجين VSG في الموقع التعبير النشط، أو عن طريق تفعيل النسخي من موقع تعبير صامت سابقا (إعادة النظر في 1).
على الرغم من الكثير من العمل وقد كرس لفهم الاختلاف الأنتيجين في T. البروسية، والعوامل التي تؤثر على تردد التبديل لا تزال غير مفهومة. تعرقلت الدراسات حتى الآن من حقيقة أنه في حين أن يحدث التحول عشوائيا في المختبر، ترددات التحول منخفضة جدا، بناء على أمر من 1 في حوالي 10 6 خلايا 2. وهذا يجعل من الصعب قياس ما إذا كان إعطاء زيادة عامل أو تنخفض وتيرة التحول، منذ التحول من الصعب كشف في المقام الأول. قبل عام 2009، كانت طرق لعزل المحولات في عدد معين من السكان طويلة وكثيفة العمالة. هذه الركض المثقبيات من خلال الفئران تحصين ضد VSG المهيمن ومن ثم حصاد الخلايا شملتفي اليوم التالي 3، أو عد مئات من الخلايا المناعي 4،5. وتعتمد استراتيجية أخرى في الاختيار لمقاومة المخدرات لعزل المحولات 6. لأن المثقبيات الأفريقي نمت في المختبر يتم عادة تتكون من عدد كبير من السكان معربا عن البديل رئيسي واحد، ويبلغ عدد سكانها أقل بكثير من المحولات التعبير عن المتغيرات بديلة، نشير إلى البديل الرئيسي في هذه الورقة باعتبارها المهيمنة، بدءا VSG. في القيام بذلك، ونحن في أي وسيلة ترغب في الإيحاء بأن هذا البديل الرئيسي لديه لياقة بدنية أكبر من المتغيرات الأخرى في عدد السكان.
نحن هنا تصف طريقة التي يمكن قياس موثوق عدد المثقبيات تعبر عن VSG غير المهيمن في عدد معين من السكان في 3-4 ساعة. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لعند واحد يريد التأكد ما إذا كان التلاعب الجيني معين أو العلاج من تعاطي المخدرات يزيد من عدد الخلايا تحولت في عدد السكان. بدلا من تخليص السكان من الخلايا معربا عن افعلminant، بدءا VSG من خلال العقاقير أو عن طريق المناعية، يتم التخلص من هذه الخلايا عن طريق طلاء لهم أولا مع حبات مغناطيسية بالإضافة إلى الأجسام المضادة ضد VSG المهيمن ومن ثم عزلهم على عمود المغناطيسي. السكان تحولت بعد ذلك جمع في التدفق من خلال وملطخة مرة أخرى مع fluorophore المسمى الأجسام المضادة لمكافحة VSG لتحديد الملوثات. ويتحقق الكمي من خلال إضافة عدد محدد من الخرز العد المطلقة على كل عينة بحيث نسبة من الخرز إلى خلايا يمكن تحديد وتستخدم لتحديد عدد من المحولات في عدد السكان 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
وفيما يتعلق تقنية تجريبية، وأهم عنصر من البروتوكول هو الحفاظ على جميع العينات البرد. المثقبيات استيعاب بسرعة كبيرة الأجسام المضادة بد أن سطحها 9، ولكن هذه العملية هو الحركة التي تعتمد، ولا تؤثر على فحص طالما يتم الاحتفاظ الخلايا في 4 درجات مئوية. وينبغي دائما أ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نعترف جورج الصليب للحصول على المشورة العامة في الأحياء المثقبيات. وأيد هذا العمل أيضا من قبل مؤسسة بيل وميليندا غيتس الحملة العالمية للتعليم منحة لDS، وجبهة الخلاص الوطني العليا زمالة أبحاث (DGE-1325261) لMRM والمعاهد الوطنية للصحة / NIAID (منحة # AI085973) إلى FNP. نشكر Galadriel الكوخ، مينر للاستخدام من سلالة يحتوي على موقع الجين والاعتراف I-SCEI.
Materials
| unlabeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| fluorophore labeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| HMI-9 media | n/a | n/a | HMI-9 is made in house |
| Propidium Iodide | BD Pharmingen | 556463 | |
| CountBright absolute counting beads | Thermofisher Scientific | C36950 | |
| LD columns | Miltenyi Biotech | 130-042-901 | |
| MACS magnet | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| MACS magnetic separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| vortex adapter-60 | ThermoFisher scientific | AM10014 | |
| flow cytometer | Coulter | n/a | |
| flow cytometer analysis software | FloJo | n/a |
References
- Horn, D. Antigenic variation in African trypanosomes. Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).
- Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei. Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).
- Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).
- Turner, C. M., Barry, J. D. High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections. Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).
- Miller, E. N., Turner, M. J. Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei. Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).
- Horn, D., Cross, G. A. Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro. Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).
- Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes. PLoS Biol. 6 (7), e161 (2008).
- Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei. Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).
- Engstler, M., Pfohl, T., et al. Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes. Cell. 131 (3), 505-515 (2007).
- Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei. Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).
