Raportör fareler kullanılarak IL-22 eksprese eden lenfositlerin Görselleştirme
Summary
We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.
Abstract
Raportör farenin geniş hedef genlerin ekspresyonu lokalizasyonunu gözlemlemek için kullanılmıştır. Bu protokol, yeni bir transgenik muhabiri fare modeli kurmak için bir strateji üzerinde duruluyor. Biz bu sitokin inflamasyon ile hasarlı dokuların tamir katkıda bağırsak, önemli etkinlikleri de olduğundan interlökin (IL) 22 gen ifadesini görselleştirmek için seçti. Haberci sistemler arasında, in vivo olarak ürünlerin belirlenmesi için diğer yöntemlere göre önemli avantajlar sunmaktadır. IL-22 olması durumunda, diğer çalışmalar, ilk doku hücreleri izole olan ve daha sonra in vitro olarak hücrelerin yeniden uyarılır. IL-22, normal olarak salgılanır, bir ilaç ile hücre içinde sıkışıp edildi ve hücre içi boyama görselleştirmek için kullanılmıştır. Bu yöntem, IL-22 üretebilen hücreleri tanımlayan, ancak in vivo olarak bunu yaparken olup olmadığını o karar vermez. raportör tasarımı, WA, IL-22 geni bir floresan proteini (tdTomato) bir gen sokulması içerirfloresan protein nedenle salgılanır ve edilemez Y in vivo üreten hücrelerin içinde sıkışıp kalmaktadır. Floresan üretici daha sonra doku kesitlerine ya da akış sitometrisi ile ex vivo olarak analiz ile görselleştirilebilir. muhabir gerçek inşaat süreci, IL-22 geni içeren bir bakteriyel yapay kromozom Recombineering dahil. Bu işlenmiş kromozom sonra fare genomu içine verilmiştir. Homeostatik IL-22 raportör ekspresyonu Akışkan sitometri analizi ile dalak, timus, lenf düğümleri, Peyer ve bağırsak dahil olmak üzere, farklı fare dokularda gözlenmiştir. Kolit T hücresi (CD4 + CD45RBhigh) transferiyle uyarılır, ve raportör ekspresyonu gözlendi. Pozitif T hücreleri mezenterik lenf düğümleri ilk mevcuttu, ve sonra onlar distal ince bağırsak ve kolon dokularının lamina propria içinde birikmiş. BAC'ler kullanarak strateji, IL-22 Expres kıyasla iyi sadakat muhabiri ifade verdision ve knock-in prosedürleri daha basittir.
Introduction
haberci genlerin hücre tipi spesifik ifade aktif homeostatik ve tedirgin halleri altında dokularda hedef ifade eden hücreleri belirlemek için yararlıdır. Bu ayrıca diğer özelliklerini incelemek için, canlı kalır, bu hücrelerin, saflaştırılması için izin verir. Raportör farenin özgü sitokinlerin transkripsiyon faktörleri ve düzenleyici elemanlar için eylem mekanizmasını açıklamaya kullanılabilecektir. Önceki stratejiler 1, 2, 3, büyük ölçüde fare kromozomu, zaman alıcı ve masraflı prosedürde hedef yörüngesi içine muhabiri vurma yararlanmıştır. Bu nedenle, raportör farelerin üretimi için daha basit bir yönteme ihtiyaç vardır.
Sitokinler hücrelerarası sinyalizasyon ile immün yanıtları düzenleyen küçük, salgılanan proteinler / peptidlerin geniş bir sınıfıdır. İnterlökin 22 (IL-22), birçok ile sitokin bariyer fu dahil aktiviteler bildirilmiştirnction, doku tamiri ve inflamasyon 4. IL-22 ilk olarak bir T-hücre ürün 5 ile tespit edilmiştir, ancak, daha sonra rapor insanlarda 6 ve fareler 7 ve doğuştan gelen lenfositlerin 8 diğer sınıfları doğal öldürücü (NK) hücreleri içinde ekspresyonu gösterdi. Antikorlarla lekelere IL-22, daha önce gerekli olan ex vivo stimülasyonu ve geçirgenliği ve geniş bir IL-22 üreten hücrelerin gözlem, görselleştirme rağmen. Bu nedenle, yeni IL-22 raportör fareler homeostatik ve patojenik süreçlerde IL-22 fonksiyonunu araştırmak için çok yararlı bir araç olacaktır.
Burada, in vivo ve in vitro olarak IL-22 üreten hücreleri gözlemlemek için basitleştirilmiş bir transgenik raportör fare modeli geliştirilmiştir. BAC Recombineering yöntemi 9 kullanarak, IL-22 loc olarak Poli A sinyal parçalarını tdTomato cDNA dizisini takılıUS ve mümkün olduğu kadar IL-22 doğal düzenleme taklit mi zira diğer dönüştürülmemiş bölgeleri, eksonlan ve düzenleyici elemanları, tedirgin değil ekson 1 yerini aldı. bildirici ekleme yeri IL-22 kendisi hızlı bir şekilde salgılanır aksine üreten hücrelerin içindeki muhabir birikmesine yol açar, sinyal dizisini bozar. Bu yeni yöntem, diğer salgılanan proteinler için haberci farelerin üretimi için uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
IL-22 doğal konukçu savunma ve dokuların yeniden yapılandırılmasında önemli bir rol oynar. IL-22 üreten hücreler hücre içi boyama ile ex vivo olarak tespit edilmiştir. Ancak, hala normal durumda ya da iltihabi durumların ya, in situ, IL-22 ifadesini izlemek için zordur. Bu protokol, in vivo olarak raportör-ifade eden hücreleri lokalize sağlıyor bir IL-22 raportör fare modeli geliştirmek için yeni bir metot açıklanır. haberci gen kodlayan tdTomato sinyal dizisini bozan …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).
Materials
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
References
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
- Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
- Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
- Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
- Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
- Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
- Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
- Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
- Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
- Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
- Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11 (2009).
- Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
- Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
- Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991 (2008).
- Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
- Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
- Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
- Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, d. e., R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
- Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
- Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).
