La visualización de IL-22 que expresan linfocitos utilizando ratones Reporter
Summary
We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.
Abstract
reportero ratones han sido ampliamente utilizados para observar la localización de la expresión de determinados genes. Este protocolo se centra en una estrategia para establecer un nuevo modelo de ratón transgénico reportero. Elegimos para visualizar la expresión de genes de interleucina (IL) 22, porque esta citocina tiene actividades importantes en el intestino, donde contribuye a reparar los tejidos dañados por la inflamación. Los sistemas indicadores ofrecen considerables ventajas sobre otros métodos de identificación de productos en vivo. En el caso de IL-22, otros estudios habían aislado primero las células de los tejidos y luego se volvieron a estimular las células in vitro. IL-22, que normalmente se secreta, estaba atrapado dentro de las células usando un fármaco, y la tinción intracelular se utiliza para visualizar la misma. Este método identifica células capaces de producir IL-22, pero no determina si lo hacían en vivo. El diseño reportero incluye la inserción de un gen de una proteína fluorescente (tdTomato) en el gen IL-22 en un wa talesy que la proteína fluorescente no puede ser secretada y por lo tanto permanece atrapado dentro de las células productoras en vivo. Productores fluorescentes pueden ser visualizados en secciones de tejido o por análisis ex vivo a través de citometría de flujo. El proceso de construcción real para el reportero incluido recombinería un cromosoma artificial bacteriano que contenía el gen de IL-22. Se introdujo entonces este cromosoma por ingeniería genética en el genoma del ratón. IL-22 expresión reportero homeostático se observó en diferentes tejidos de ratón, incluyendo el bazo, timo, ganglios linfáticos, placas de Peyer, y el intestino, por citometría de flujo análisis. La colitis se indujo mediante la transferencia de células T (CD4 + CD45RBhigh), y la expresión del indicador se visualizó. células T positivos fueron primero presente en los ganglios linfáticos mesentéricos, y luego se acumulan dentro de la lámina propia de los pequeños tejidos delgado y el colon distal. La estrategia de usar BAC dio expresión del indicador buena fidelidad en comparación con IL-22 expresSion, y es más simple que los procedimientos de knock-in.
Introduction
Celular de expresión de tipo específico de genes informadores es útil para identificar células que expresan activamente el objetivo en los tejidos debajo de estados homeostáticos y perturbados. También permite la purificación de estas células, que se mantienen viables, para estudiar sus otras propiedades. reportero ratones se han utilizado para elucidar el mecanismo de acción de citoquinas específicas, factores de transcripción, y elementos reguladores. Estrategias anteriores 1, 2, 3 se han basado en gran medida en golpear el reportero en el locus diana en el cromosoma de ratón, un procedimiento que consume tiempo y costoso. Por lo tanto, un método más simple para la generación de ratones reportero es deseable.
Las citoquinas son una amplia clase de pequeñas, proteínas secretadas / péptidos que regulan la respuesta inmune a través de la señalización intercelular. La interleucina 22 (IL-22) es una citoquina con muchas actividades reportados, incluyendo fu barreranción, reparación de tejidos, la inflamación y 4. Aunque la IL-22 se descubrió inicialmente como un producto de las células T 5, los informes posteriores demostraron su expresión en las células asesinas naturales (NK) en los seres humanos y los ratones 6 7 y en otras clases de linfocitos innatas 8. A pesar de una extensa observación de las células productoras-22 IL, visualización de la IL-22 se requería previamente la estimulación ex vivo y permeabilización a las manchas con anticuerpos. Por lo tanto, la novela de IL-22 reportero ratones serían una herramienta muy útil para investigar la función de IL-22 en los procesos homeostáticos y patógenos.
Aquí, hemos desarrollado un modelo de ratón transgénico reportero simplificada para observar las células IL-22-que producen in vivo e in vitro. El uso de un método de BAC recombinería 9, insertamos la secuencia de ADNc tdTomato con poli A fragmentos de señal en el loc IL-22nosotros y reemplazado exón 1. Las otras regiones, los exones, y elementos reguladores sin traducir no fueron perturbados, ya que nos gustaría imitar la regulación natural de la IL-22 tanto como sea posible. El sitio de inserción reportero interrumpe la secuencia señal, lo que resulta en la acumulación de la reportera en el interior de las células que producen, a diferencia de IL-22 en sí, que es secretada rápidamente. Este nuevo método puede aplicarse también a la generación de ratones reportero de otras proteínas secretadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
IL-22 juega un papel esencial en la defensa innata y tejido huésped remodelación. Células-22 productoras de IL han identificado ex vivo mediante tinción intracelular. Sin embargo, sigue siendo difícil de rastrear la expresión de IL-22 in situ, ya sea en el estado normal o en condiciones inflamatorias. Este protocolo describe un nuevo método para desarrollar un IL-22 reportero modelo de ratón, lo que nos permite localizar las células indicadoras que expresan in vivo. El gen informador …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).
Materials
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
References
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