辅助性T细胞作为一种遗传方法来研究逆转录病毒转导机制控制其分化和功能

在这些协议进行的所有小鼠的工作被按照动物项目许可六千九百六十五分之七十零下动物科学程序法，英国进行的。 1.逆转录病毒生产在此之前继续获得所有必要的批准生产转基因生物和在哺乳动物细胞中使用逆转录病毒。 HEK 293T细胞生长 上生长的HEK 293T介质10厘米组织培养皿的HEK 293T细胞（含10％胎牛血清的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基（DMEM）（FBS），100单位/ ml青霉素0.1mg / ml的链霉素和2mM L-谷氨酰胺） 。对于一般细胞传代，拆分单元格1:10，当他们通过去除中，吹打关闭单元的新鲜HEK 293T介质板达到汇合。 注意：细胞应在2-3天达到汇合。 293T HEK细胞松散附着到这样的胰蛋白酶消化不需要板。 24小时前转，拆分conflue细胞1:10至10cm平板（每个转染一个板），使得在第二天，细胞是〜50％汇合的核苷酸板。 通过转染磷酸钙沉淀 转染前约1小时，从细胞中取出，小心可加9毫升新鲜HEK 293T介质，以防止细胞的分离板。 制备2倍的Hepes缓冲盐水（2×HBS）和一个新鲜的2.5M的CaCl 2溶液，如表1所述。解冻的DNA股。为了最有效地使用转染质粒制备高质量的DNA。 在6毫升圆底或15毫升锥形管中添加5微克的逆转录病毒的DNA（pMIG）4，辅助病毒DNA（PCL-ECO）7 5微克，和H 2 O至420微升。添加80微升的2.5M的CaCl 2使终体积为500微升。 注：此下一步骤（另外2个HBS）的沿可在常规替补，只要做一般韦伯斯特使用ILE技术。 慢慢逐滴加入500μl2×HBS下降到上述DNA混合物中，同时轻轻地涡旋以使溶液连续地混合，该课4在偶数大小的晶体沉淀。 转移到组织培养罩和缓慢的CAPO 4 DNA混合物（1毫升）逐滴添加到9毫升培养基覆盖细胞，同时不断地和轻轻摇动板。再次要注意不要从板块分离细胞。放置细胞放回培养箱中。 注意：此时该课4沉淀物将是一个显微镜对细菌的尺寸小晶体下容易看见。当该晶体有机会沉降到板的底部，这些很容易被后30-60分钟看到。 培养上清病毒的集合。 翌日（从转染后12-24小时的任何地方）除去培养基并用10毫升喂细胞新鲜HEK 293T中再次小心不要从板块打跑细胞。 注意：这冲淡了该HEK 293T细胞分泌到转染在媒体淋巴细胞抑制物质。 在第二天（〜24小时后转染）晚上喂3.5毫升新鲜HEK 293T中的细胞。请注意，该板置于水平究竟在孵化器，使一方不剩干燥。 收集中等〜12小时后（在4℃存储）和饲料3.5毫升新鲜HEK 293T介质。重复收集2次以上在大致使约10ml培养基的收集12小时的时间间隔。这是在病毒原液。 通过在600 xg离心离心5分钟旋出任何残余的HEK 293T细胞和细胞碎片。可替代地，过滤用0.45微米，低蛋白质结合，注射器过滤器。商店病毒在4℃，最佳滴度，用一两天之内，因为滴度会慢慢在4℃减弱。不要酒店frEEZE，因为这显著降低滴度。 2.主朴素的 CD4 + T细胞的分离 白细胞细胞的分离 安乐死颈椎脱位，CO 2窒息，或适合于机构的动物处理规则等人性化协议老鼠。 解剖新鲜安乐死的小鼠并取出脾脏和所需的淋巴结15。放置器官中含有R10培养基（含10％热灭活的FBS，100单位/ ml青霉素，0.1mg / ml的链霉素，2mM的L-谷氨酰胺和0.1％β巯基乙醇的RPMI培养基）6-孔组织培养板的孔中。使用细胞培养罩老鼠和所有后续操作的解剖，以尽量减少在培养污染的机会。 注：保持R10培养基冷并在4℃下执行所有的下游纯化步骤。 将70微米的细胞培养过滤成50毫升含有约5mL R10培养基的锥形管中。使用最多三个小鼠的脾和淋巴结节点的一个过滤器。 添加脾和淋巴结的细胞过滤并用5ml的针筒柱塞的端部浸渍。用1-2毫升R10介质的冲洗。 细胞转移到15毫升锥形管，并把音量高达14毫升R10。离心机在600×g离心在4℃下5分钟。通过一个干净的运动浇，以防止干扰细胞沉淀弃上清。 2毫升冷（4℃）红细胞裂解缓冲液（ 表1）添加到每个管中。轻轻混合3.5分钟，保持管冰。 注：红细胞裂解的时间是关键的，以防止淋巴细胞死亡。因此，红细胞裂解缓冲液的每批的精确定时将需要进行优化。 加入≈12-13毫升R10介质。立即离心弃上清如步骤2.1.5。执行洗涤步骤2倍多才子ħR10培养基从细胞中除去任何残余的红细胞裂解缓冲液，并避免淋巴细胞死亡。 计数血球在锥虫蓝稀释1:20，确定活细胞的细胞产量。期望每只小鼠大约8-10×10 7个细胞。 利用磁珠套件CD4 + T细胞的分离删除CD8 +细胞CD11b +，CD16 / 32 +，+ CD45R，MHC II +类和泰尔-119 +细胞。 等分试样8-10×10 7细胞从步骤2.1.8每的15毫升锥形管中并在600×g离心5分钟离心在4℃下。倒出与一种清洁运动上清液，以防止干扰细胞沉淀。悬浮细胞在100微升的热灭活的FBS，然后从该试剂盒中添加100μl的抗体混合物的每管中。带在辊温和混合孵育30分钟，在4℃。 虽然上述细胞培养，准备珠。 在小瓶中通过涡旋> 30秒重悬珠子然后用1毫升每8-10×10 7制备的细胞珠转移到15毫升锥形管中。加入2毫升R10中每毫升的珠子，轻轻混匀。 放置管在磁体1分钟，然后弃上清。从磁体和重悬珠子在4毫升R10培养基中除去管。珠这一数额足以两轮孵化。 通过加入10毫升，每管R10培养基洗细胞在抗体孵育（步骤2.2.1）的端部。轻轻地用管和离心细胞回旋在600 xg离心在4℃下充分混合5分钟。倒出与一种清洁运动上清液，以防止干扰细胞沉淀。悬浮细胞在1ml R10培养基中。 从步骤2.2.2.2（½每个管中制备的量），以抗体处理的细胞的每个管中加入2毫升的洗涤珠子，并在4℃下与一ロ温和混合孵育30分钟米勒。 通过用含有一个窄尖端开口吸管轻轻吹打5倍重悬细胞 – 珠混合物。避免起泡。放置管中的珠磁铁为2分钟，然后载负选择的细胞的上清转移到新管中。保持这些细胞，因为它们是CD4 +群体。 重复阴性选择一次。旋转细胞从步骤2.2.5在600 xg离心在4℃下5分钟。倒掉上清如步骤2.2.3重悬在1毫升R10介质。按照步骤2.2.4和2.2.5一次。最终磁珠选择之后，计数细胞，以确定恢复（典型产率是每10 8白细胞15-20×10 6个细胞）。 使用细胞分离柱-朴素的 CD4 + T细胞（和CD62L 高 CD25）的分离 离心机CD4 + T细胞在600×g离心5分钟，在4℃，重悬在150-200微升每10 8个细胞R10网上平台。加入2微升股票生物素的CD25单克隆抗体（克隆7D4）的。带在辊温和混合孵育30分钟，在4℃。 通过加入10ml的细胞分离柱缓冲液（ 表1）洗涤细胞。离心机在600×g离心在4℃下5分钟。除去尽可能多的上清液尽可能并估计剩余缓冲器/细胞的体积。悬浮到每10 7个细胞大约90微升的最终体积。 加入20微升每10 7个细胞链亲和素珠和温柔的笔触混合。孵育在4℃下15分钟。 当细胞培养，制备培养基细胞分离（MS）列手动方法。每个MS柱保留10 7个细胞，并自CD25 +细胞通常代表总CD4 +细胞的约10％，每10 8 CD4 + T细胞使用1列。加入500微升细胞分离柱缓冲液向柱让流过。重复2次以上。 在细胞/珠温育结束时，通过加入10ml的细胞分离的柱缓冲液中，并在4℃以600 xg离心离心5分钟洗涤细胞。重悬在500微升每10 8个细胞的细胞分离柱缓冲液的细胞，但仍使用500微升，如果有较少的细胞。 应用500微升细胞/珠悬液到柱，并收集通过的流动。通过这个在第1列更多的时间，并通过再次收集流程。冲洗柱用500μl细胞分离柱缓冲液3次，将每个从这些漂洗流经收集到的细胞中。这些是CD25 -细胞。计数细胞，以确定产量。 如果调节性T细胞（CD25 +细胞）被需要的话，隔离如下。 从分离器中取出柱，守住一个开放的通用管照顾它保持无菌。快速吸取500微升细胞分离缓冲到山坳柱，并牢固地冲洗出阳性部分，使用与列提供的柱塞。 重复冲洗步骤2次以上。越过一个新的MS细胞分离柱的阳性率和丢弃此流过。牢牢冲洗出阳性细胞三次，如前离心细胞以600×g离心5分钟，在4°C重悬细胞于1ml R10培养基中并计数，以确定产率。 为了获得CD25 – CD62L 高的T细胞，离心后CD25 -上面的步骤2.3.6在600 XG在150-200微升每10 7细胞R10介质中分离出5分钟，在4°重悬T细胞。添加5微升的库存的生物素化的CD62L单克隆抗体（克隆MEL-14）和如前孵育在4℃下温和混合在辊30分钟。 执行洗涤，链霉珠结合，和细胞分离柱制备作为用于调节性T细胞分离方案（2.3.7）中所述。这次使用大细胞分离（LS）柱，其具有10 8个细胞的容量。 由于CD62L 高的T细胞通常表示CD25的约60-70％ -细胞，利用每10 8个细胞1 LS细胞分离柱。细胞/珠的混合物添加到LS细胞分离柱如步骤2.3.6描述 – 这时候放弃最后流过和列冲洗。收集CD62L 高 T细胞在步骤2.3.7为CD25 +细胞采集描述。 离心细胞以在1毫升R10 600×g离心5分钟，在4°C悬浮细胞并计数，以确定产率。稀释至0.75-1 X10每毫升6细胞R10网上平台。 通过荧光激活细胞分选（FACS）分析细胞纯度。 FACS染色策略对于细胞前后的孤立的各个阶段，污渍与CD4-FITC，CD8A-PerCP-经Cy5.5（辅助性和细胞毒性T细胞），并MHCIⅠ-PE（MHC II类表达细胞）。 对于细胞前后的CD25隔离，染色与CD4-FITC和CD25-PE（调节性T细胞与其他辅助性T细胞）。 对于细胞前，后CD62L隔离带污迹的CD4-FITC，CD62L-PE和CD44-APC（天真与内存和效应辅助性T细胞）。 对于每个分析地点10 5个细胞在96-孔U型底的板的孔中。离心机在600×g离心在4℃下5分钟。倒出培养基，并用200μlDPBS洗一次细胞。如上离心倒出DPBS。 添加每孔的DPBS 50和0.5μl各抗体（如2.4.1所示）的孵育在室温下进行30分钟，在黑暗中以避免荧光标记的漂白。 洗涤细胞2倍用DPBS如在2.4.2和立即分析关于流式细胞仪使用特定于手头的仪器的协议和准则的流程。 注：做好准备的最后分离步骤后，细胞的90-95％将是CD4 + CD25 – CD62L 高的T细胞。 3.逆转录病毒激活CD4 + T细胞转导并分化为特定的T辅助亚群 逆转录病毒转导 注：逆转录病毒整合和基因的表达需要细胞分裂。因此，T细胞必须被激活O / N。 而分离幼稚T细胞，外套24孔组织培养板用抗CD3和在DPBS稀释的抗CD28抗体。加入每孔250微升。在1微克/毫升使用防抗CD3。使用抗CD28在2微克/毫升，如果细胞将最终的Th0，Th1细胞，Th2和iTregs的条件下加以区分。使用抗CD28以10微克/毫升为TH9和Th17的条件。孵育在37℃〜2小时在组织培养箱。 培养所述细胞之前，为了，除去抗体溶液并用〜250微升每孔的DPBS除去unbou的洗涤板ND抗体。小心不要让板干出这么一次最多6口井的处理。除去DPBS洗，并在每毫升0.75-1×10 6细胞加入1毫升幼稚的 CD4 + T细胞在R10介质。活化细胞O / N（14-16小时）。 第二天，离心细胞，在900×g离心5分钟，该板在30℃下附着的细胞至孔的底部。 收集并保存小心不要置换细胞的培养基，并使用从病毒生产方案制备1毫升病毒培养上清液更换。不要让细胞干出这么一次最多4口井处理。 向每个孔中加入8毫克/毫升聚凝胺的1微升和10μl1M HEPES pH为7.5的以有助于病毒的摄取，并防止下面的离心分离期间在环境CO 2显著碱化。离心细胞，在900×g离心90分钟板在30℃。 细胞向规格分化FIC子集小心地取出病毒培养物上清液并用1ml的培养基中步骤3.1.4上述收集替换，因为它包含的IL-2和其它的T细胞生长因子。加入表2和培养细胞表示3-4天分化细胞分化成特定子集试剂。 细胞分析 对于细胞因子的细胞内染色，处理细胞用1μg/ ml的每种的佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）和离子霉素为4小时。在刺激后2小时，加入1μg/ ml的布雷菲德菌素A的从每个孔的底部悬浮细胞通过上下吹打数次。输送约10 5个细胞在96孔U底板（通常为100微升从1ml的Th细胞的培养物），用于固定和染色。 对于GFP染色，固定用100微升2％多聚甲醛的细胞在室温整整5分钟，因为一个较长的培育时间将漂一GFPND与Foxp3的染色干扰。通过在22℃在600 xg离心加入100微升DPBS的每个孔中，离心5分钟洗涤细胞。倒出上清液。 注意：多聚甲醛是有毒的。处理它与皮肤和眼睛的保护在通风橱。 固定再次使用从所述的Foxp3染色试剂盒（1体积固定缓冲液至3体积的稀释剂）由100微升1×固定缓冲液的细胞。孵育45分钟的细胞在室温或4℃备选地孵育16小时。 固定后，通过从相同的试剂盒，加入100微升透化缓冲液的通透细胞。孵育在室温30-45分钟，然后在600 xg离心22℃离心5分钟。 对于抗体染色，除去固定/通透缓冲液，加入50微升清新通透缓冲。加入通透缓冲液稀释所需的抗体在每个样品每50微升0.5微升缓冲。在黑暗中孵育30-45分钟，在室温，以避免感漂白orescent标签。 在600 XG添加150微升透化缓冲液和离心机在22℃5分钟。丢弃通透缓冲区，并添加200微升DPBS。流式细胞仪上使用特定手头的仪器协议和指导方针流量分析。 注意：一定要包括细胞因子染色适当控制，例如同型对照抗体染色，分析非激活或激活的Th0细胞等