La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em> En Vivo</em> El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

El objetivo general de este método consiste en evaluar y cuantificar la fagocitosis microglial vivo con precisión. La microglía son los macrófagos residentes tejido del sistema nervioso central (SNC). Se realizan una variedad de funciones para asegurar el mantenimiento de la homeostasis del tejido. Estos incluyen la vigilancia inmunológica, la secreción de factores neurotróficos y, de importancia fundamental, la fagocitosis ^1. Fagocitosis microglial es clave en varios eventos importantes durante el desarrollo del cerebro y la retina, tales como fagocitosis de las sinapsis irrelevantes (poda sináptica) y la eliminación de las neuronas apoptóticas ^2-4. Además, la fagocitosis microglial de las neuronas dañadas o apoptóticos, restos celulares, y los microbios invasores se ha demostrado ser esencial para el mantenimiento de la homeostasis del SNC a través de la edad adulta ^5. Por último, la fagocitosis microglial ha sido implicado en la patogénesis de varias enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer y relacionados con la edaddegeneración macular, donde se ha sugerido que la capacidad de fagocitosis defectuosa o insuficiente puede contribuir a la acumulación de amiloide-beta placas (Aß) y drusas, respectivamente ^6,7.

función Microglial está estrechamente regulada por su microentorno, en particular por factores solubles, tales como el factor de crecimiento del tumor interacciones célula-célula o β. Las neuronas expresan constitutivamente varios ligandos de la superficie celular, tales como CD200 y CX3CL1, mientras microglia exclusivamente expresan los respectivos receptores CD200R y CX3CR1. Estos receptores contienen inmunorreceptoras motivos de inhibición basado en tirosina (ITIM) en su porción intracelular. Estos inhibidor de los receptores son críticas para la prevención de la estimulación más de microglia, que puede contribuir a la neuroinflamación. Por lo tanto, en condiciones fisiológicas normales, las interacciones célula-célula entre las neuronas y la microglia mantienen microglia en un estado de reposo. Durante la lesión tisular, sin embargo, las neuronas pueden regular a la baja expresión de estos ligandos, la eliminación de su efecto inhibidor sobre la activación de la microglia. Función microglial (incluyendo la fagocitosis) está por lo tanto estrechamente vinculada a su microambiente ^8. Sin embargo, hasta la fecha, no hay ensayos estandarizados para estudiar la fagocitosis microglia en un contexto fisiológico o de una manera que se replica completamente su microambiente del SNC.

Varios ensayos han sido desarrollados para medir la actividad fagocítica de microglia in vitro, donde microglia primarias o líneas de células de microglia se cultivan con las células diana (por ejemplo, neuronas apoptóticas) o perlas marcadas fluorescentemente. Captación objetivo es evaluada mediante microscopía de imágenes fluorescentes o citometría de flujo ^9-12. Estos ensayos permiten realizar pruebas de cómo la manipulación farmacológica o genética puede afectar a la fagocitosis microglial y, mientras informativa, no logran replicar completamente el complejo entorno en vivo. Los métodos indirectos para el examen de la fagocitosis microglialin vivo se han reportado: estos se llevan a cabo por tinción de las moléculas se cree que participan en la fagocitosis (por ejemplo, CD68), la evaluación de la proximidad física de la microglía y los objetivos para la fagocitosis (por ejemplo, neuronas comprometidas o elementos sinápticas), o por detección inmunohistoquímica de fagocítica los objetivos dentro de las células microgliales (por ejemplo, Aß) ^13-17. Dos estudios han utilizado métodos más directos para evaluar la fagocitosis microglia in vivo. Hughes y sus colegas han utilizado técnicas de imagen para determinar el consumo de microglial de cuentas entregadas por vía intracraneal ^18. Sierra et al. Desarrolló un método perfeccionado para evaluar cuantitativamente la fagocitosis de las células apoptóticas microglia utilizando técnicas de imagen complejas ^4. Sin embargo, estos métodos implican protocolos complicados para la preparación del tejido, seccionamiento, proyección de imagen, y el análisis. Hemos utilizado anteriormente análisis de citometría de flujo para evaluar la fagocitosis de los fotorreceptores a caboer segmentos de células de la retina epitelio pigmentario (RPE) en cultivo ^19. A continuación, se describe un protocolo para evaluar rápidamente la captación de partículas marcadas con fluorescencia por la microglía de la retina como una medida cuantitativa de la fagocitosis in vivo microglia.

El protocolo se describe aquí permite una medición fiable y cuantitativa de la fagocitosis microglial de la retina en poco menos de seis horas en tres pasos fundamentales: (1) la entrega intravítrea de partículas marcadas con fluorescencia, (2) la cosecha y preparación de tejido de la retina, y (3) el flujo de análisis de citometría. El método que hemos desarrollado es un método robusto para evaluar la fagocitosis microglial en la retina, y puede ser utilizado con éxito para probar cómo varios compuestos o manipulación genética alteran esta función microglial clave en la configuración fisiológicas. Como un área especializada del sistema nervioso central, la retina es un modelo de sistema de fácil acceso para estudiar la función de la microglia ^20. Si bien este método fue desarrollado en tque ojo, creemos que puede ser útil para todos los neurólogos que investigan la función microglía fagocítica.