Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em> In Vivo</em> Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es , genau zu beurteilen und in vivo Mikroglia Phagozytose zu quantifizieren. Mikroglia werden die Gewebe Makrophagen des zentralen Nervensystems (ZNS). Sie führen eine Vielzahl von Funktionen, die Wartung von Gewebshomöostase zu gewährleisten. Dazu gehören Immunüberwachung, Sekretion von neurotrophen Faktoren und von zentraler Bedeutung, Phagozytose ^1. Mikroglia Phagozytose ist der Schlüssel in mehrere wichtige Ereignisse während der Entwicklung des Gehirns und der Netzhaut, wie Phagozytose irrelevanter Synapsen (synaptic pruning) und Entfernung von apoptotischen Neuronen ^2-4. Weiterhin wurde für die Aufrechterhaltung der Homöostase CNS durch Erwachsenenalter ⁵ wesentlich zu sein Mikroglia Phagozytose von beschädigten oder apoptotischen Neuronen, Zelltrümmer und eindringenden Mikroben gezeigt. Schließlich hat Mikroglia Phagozytose in der Pathogenese von verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen in Zusammenhang gebracht, einschließlich Alzheimer-Krankheit und altersbedingteMakula – Degeneration, wo es wurde vermutet , dass defekte oder unzureichende Phagozytosekapazität zum Aufbau von Amyloid-β (Aß) Plaques und Drusen, die jeweils ^6,7 beitragen können.

Mikroglia-Funktion wird fest durch ihre Mikroumgebung geregelt, insbesondere durch lösliche Faktoren wie Tumor-Wachstumsfaktor-β oder Zell-Zell-Interaktionen. Neuronen exprimieren konstitutiv mehrere Zelloberflächenliganden, wie beispielsweise CD200 und CX3CL1, während Mikroglia ausschließlich die jeweiligen Rezeptoren CD200R und CX3CR1 exprimieren. Diese Rezeptoren enthalten immunoreceptor Tyrosin-basierte Hemmung Motive (ITIMs) in ihrem intrazellulären Teil. Dieser Inhibitor Rezeptoren sind wichtig zur Verhinderung der Überstimulation der Mikroglia, die neuroinflammation beitragen kann. Somit wird unter normalen physiologischen Bedingungen, Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Mikroglia halten Mikroglia in einem Ruhezustand. Bei Gewebeverletzungen kann jedoch Neuronen regulieren unten expression dieser Liganden, ihre hemmende Wirkung auf die Mikroglia-Aktivierung zu entfernen. Mikroglia – Funktion (einschließlich Phagozytose) wird so fest an ihrer Mikro – ⁸ verbunden. Dennoch Bis heute gibt es keine standardisierten Assays Mikroglia Phagozytose in einem physiologischen Kontext oder in einer Weise zu studieren, die vollständig ihre ZNS-Mikroumgebung repliziert.

Phagozytische Aktivität von Mikroglia in vitro zu messen entwickelt, bei denen primäre Mikroglia oder Mikroglia – Zelllinien kultiviert werden , mit den Zielzellen (zB apoptotischen Neuronen) oder fluoreszenzmarkierte Kügelchen mehrere Assays wurden. Zielaufnahme wird dann Fluoreszenz – Imaging – Mikroskopie oder Durchflusszytometrie ^9-12 beurteilt werden. Diese Tests ermöglichen Tests, wie pharmakologische oder genetische Manipulation Mikroglia Phagozytose beeinflussen können , und während informativ, nicht in vollem Umfang den Komplex in vivo – Umgebung replizieren. Indirekte Methoden zur Prüfung von Mikroglia Phagozytosein vivo berichtet worden: diese durch Anfärben von Molekülen erreicht werden gedacht , um in Phagocytose beteiligt sein (beispielsweise CD68), die physische Nähe der Mikroglia und Ziele für die Phagozytose (zB kompromittiert Neuronen oder synaptische Elemente) Beurteilung oder durch immunhistochemischen Nachweis von phagozytischen Ziele innerhalb von Mikroglia – Zellen (zB Aß) ^13-17. Zwei Studien haben mehr direkte Ansätze verwendet , um Mikroglia Phagozytose in vivo zu beurteilen. Hughes und Kollegen haben Bildgebungstechniken verwendet Mikroglia Aufnahme von Perlen über die intrakranielle Route ¹⁸ geliefert zu messen. Sierra et al. Entwickelten eine verfeinerte Methode zur quantitativen Mikroglia Phagozytose von apoptotischen Zellen unter Verwendung komplexer Bildgebungstechniken ⁴ bewerten. Jedoch umfassen diese Verfahren komplizierter Protokolle zur Gewebevorbereitung, Sektionieren, Bildgebung und Analyse. Wir haben zuvor die durchflusszytometrische Analyse verwendet Phagozytose von Photorezeptor zur Bewertung auser Segmente von retinalen Pigmentepithel (RPE) Zellen in Kultur ^19. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur schnellen Beurteilung Aufnahme von fluoreszent markierten Partikel durch retinalen Mikroglia als quantitatives Maß für die in vivo Mikroglia Phagozytose.

Das Protokoll, die wir hier beschreiben, ermöglicht eine zuverlässige und quantitative Messung der retinalen Mikroglia Phagozytose in knapp 6 Stunden in drei kritischen Schritten: (1) intravitreal Lieferung von fluoreszenzmarkierten Teilchen, (2) Ernte und Aufbereitung von Netzhautgewebe, und (3) Strömungs Zytometrie Analyse. Die Methode, die wir entwickelt haben, ist eine robuste Methode Mikroglia Phagozytose in der Retina zu bewerten, und es kann erfolgreich getestet werden, wie verschiedene Verbindungen oder genetische Manipulation dieser Taste Mikroglia-Funktion in physiologischen Einstellungen ändern. Als spezialisierter Bereich des ZNS, ist die Netzhaut ein leicht zugängliches Modellsystem Mikroglia – Funktion ²⁰ zu studieren. Während diese Methode wurde in t entwickeltener Auge, glauben wir, es kann für alle Neurowissenschaftler untersuchen Mikroglia phagozytischen Funktion nützlich sein.