Évaluation Retinal microglial phagocytaire Fonction<em> In Vivo</em> L'utilisation d'un test basé sur la cytométrie de flux

L'objectif global de cette méthode est d'évaluer et de quantifier en phagocytose microgliale vivo avec précision. Les microglies sont les macrophages du système nerveux central (SNC) résidentes du tissu. Ils effectuent une variété de fonctions pour assurer le maintien de l'homéostasie tissulaire. Ceux – ci comprennent la surveillance immunitaire, la sécrétion de facteurs neurotrophiques et, d' une importance cruciale, la phagocytose ^1. Phagocytose microgliale est la clé de plusieurs événements importants au cours du développement du cerveau et de la rétine, comme la phagocytose des synapses non pertinentes (élagage synaptique) et l' élimination des neurones apoptotiques ^2-4. En outre, la phagocytose microgliale de neurones endommagés ou apoptotiques, des débris cellulaires et des microbes envahisseurs a été révélée indispensable au maintien de l' homéostasie du système nerveux central jusqu'à l' âge adulte ^5. Enfin, la phagocytose microgliale a été impliquée dans la pathogenèse de plusieurs maladies neurodégénératives, dont la maladie d'Alzheimer et liée à l'âgela dégénérescence maculaire, où il a été suggéré que la capacité de phagocytose défectueuse ou insuffisante peut contribuer à l'accumulation de l' amyloïde ß (Aß) , des plaques et des druses, respectivement ^6,7.

fonction de la microglie est étroitement régulée par leur micro-environnement, notamment par des facteurs solubles tels que le facteur β de croissance tumorale ou les interactions cellule-cellule. Les neurones expriment constitutivement plusieurs ligands de surface cellulaire, tels que le CD200 et CX3CL1, tandis que les microglies expriment exclusivement les récepteurs respectifs CD200R et CX3CR1. Ces récepteurs contiennent immunorécepteur motifs d'inhibition à base de tyrosine (ITIM) dans leur partie intracellulaire. Ces récepteurs inhibiteurs sont essentiels pour empêcher la sur-stimulation de la microglie, ce qui peut contribuer à une neuroinflammation. Ainsi, dans des conditions physiologiques normales, les interactions cellule-cellule entre les neurones et les microglies garder microglie dans un état de repos. Pendant une lésion tissulaire, cependant, les neurones peuvent réguler vers le bas expression de ces ligands, en supprimant leur effet inhibiteur sur la microglie activation. Fonction microglial (y compris la phagocytose) est donc étroitement liée à leur microenvironnement ^8. Néanmoins, à ce jour, il n'y a pas des tests standardisés pour étudier la microglie phagocytose dans un contexte physiologique ou d'une manière qui reproduit pleinement leur microenvironnement CNS.

Plusieurs dosages ont été développés pour mesurer l' activité phagocytaire des microglies in vitro, où les cellules microgliales primaires ou de lignées de cellules microgliales sont cultivées avec des cellules cibles (par exemple, les neurones apoptotiques) ou des billes marquées par fluorescence. L' absorption de la cible est alors déterminée en utilisant la microscopie à imagerie de fluorescence ou cytométrie de flux ^12/09. Ces essais permettent de tester comment la manipulation pharmacologique ou génétique peut affecter la phagocytose microgliale et, tandis que d' information, ne parviennent pas à répliquer totalement le complexe dans un environnement in vivo. Les méthodes indirectes pour l'examen de la phagocytose microglialein vivo ont été rapportés: ceux – ci sont réalisés par coloration des molécules censées être impliquées dans la phagocytose (par exemple, CD68), l' évaluation de la proximité physique des microglies et des cibles pour la phagocytose (par exemple, des neurones compromis ou éléments synaptiques), soit par détection immunohistochimique de phagocytose cibles dans les cellules microgliales (par exemple, Aß) ^13-17. Deux études ont utilisé des approches plus directes pour évaluer la microglie phagocytose in vivo. Hughes et ses collègues ont utilisé des techniques d'imagerie pour mesurer l' absorption de la microglie de perles livrées par voie intracrânienne ^18. Sierra et al. A développé une méthode raffinée pour évaluer quantitativement la microglie phagocytose des cellules apoptotiques en utilisant des techniques d'imagerie complexes ^4. Cependant, ces procédés impliquent des protocoles compliqués pour la préparation des tissus, le sectionnement, l'imagerie et l'analyse. Nous avons déjà utilisé une analyse de cytométrie de flux pour évaluer la phagocytose du photorécepteur surer segments de cellules rétiniennes épithélium pigmentaire (RPE) dans la culture ^19. Ici, nous décrivons un protocole pour évaluer rapidement l' absorption de particules marquées par fluorescence par microglie rétiniennes comme une mesure quantitative de la microglie in vivo phagocytose.

Le protocole que nous décrivons ici permet une mesure fiable et quantitative de la phagocytose microgliale rétinienne dans un peu moins de six heures en trois étapes essentielles: (1) la livraison de intravitréenne de particules marquées par fluorescence, (2) la récolte et la préparation du tissu rétinien, et (3) Flux l'analyse cytométrique. La méthode que nous avons mis au point une méthode robuste pour évaluer la phagocytose microgliale dans la rétine, et il peut être utilisé avec succès pour tester la façon dont divers composés ou manipulation génétique modifient cette fonction clé dans la microglie paramètres physiologiques. En tant que domaine spécialisé de la CNS, la rétine est un système modèle facilement accessible pour étudier la fonction de microglies ^20. Bien que cette méthode a été développée en til oeil, nous croyons qu'il peut être utile pour tous les neuroscientifiques enquête fonction microglie phagocytaire.