JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Uzun vadede bir Batık Filtre Kağıdı Sandviç<em> Ex Ovo</emErken Civciv Embriyolar> Time-lapse Görüntüleme

Published: December 28, 2016
doi:
10.3791/54636
, ,
1Department of Orthopaedic Surgery, VU University Medical Center Amsterdam,MOVE Research Institute Amsterdam, 2Department of Anatomy, Embryology & Physiology,Academic Medical Center Amsterdam

Summary

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Abstract

Kalp 7 bükme, 5, somitogenesis 6 – nedeniyle doluluk durumuna, düşük maliyetli, düz geometri ve şeffaflık, civciv embriyo ex ovo gibi gastrulasyon 2 olarak morfogenetik olayların çalışma için önemli bir omurgalı hayvan modeli, nörülasyon 3 haline gelmiştir erken embriyogenez sırasında 13 – 8, ve beyin oluşumu 9. morfogenetik süreçlerinin anlaşılması için anahtar time-lapse görüntüleme ile dinamik olarak takip etmektir. Civciv embriyogenez eski ovo zaman atlamalı filmleri toplama embriyo yaklaşık 14 sıcaklık ve nemi kontrol etmek için bir inkübatör kısa süre pencereleri veya ihtiyaca ya sınırlı kalmıştır. Burada, kültür civciv için yeni bir teknik iletilen ışık mikroskopi kullanılarak yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için ex ovo embriyolar sunuyoruz. batık filtre kağıdı sandviç köklü filtre kağıdı taşıyıcı techn bir çeşididiriQue (AT-kültür) 1 ve klima kabini gerek kalmadan piliç embriyoları kültür sağlar. Embriyo iki aynı filtre kağıdı taşıyıcılar arasında sandviç ve tam hafif mineral yağ tabakası ile kaplı basit, sıcaklık kontrollü bir ortam içinde daldırılmış tutulur. En az 28-hücre gruplarının evre (HH16) 15 kadar ilkel çizgi aşamasında (Hamburger-Hamilton aşamada 5 HH5) 15 dan başlayarak, embriyolar ya da ventral ya da dorsal yüzü yukarı bakacak kültüre olabilir. Bu embriyonik gelişim yaklaşık 30 saat kapsayan time-lapse film edinilmesini sağlar. Temsili time-lapse çerçeveleri ve filmler gösterilmektedir. Embriyolar standart AT-kültürde kültüre bir embriyo morfolojik karşılaştırılır.

batık filtre kağıdı sandviç erken dorsal ve ventral morfojenetik süreçleri incelemek için istikrarlı bir ortam sağlar. Aynı zamanda, mikro, boncuk imp olarak, canlı flüoresan görüntüleme ve micromanipulations sağlarlantation, mikroenjeksiyon, gen susturma ve elektroporasyon ve güçlü bir potansiyele sahip (ışık sayfalık mikroskobu dahil) lazer tabanlı görüntüleme için daldırma hedefleri ile kombine edilecek.

Introduction

Embriyogenezis tarihinin başlangıcından bu yana adam hayran oldu. Nasıl bir embriyo yapısı ve morfolojisi böyle bir iyi tanımlanmış zamansal ve mekansal bir şekilde gelişiyor? civciv embriyo çeşitli nedenlerle embriyogenezin klasik omurgalı hayvan modellerinden biri haline gelmiştir: anne dışında gelişen gibi, deneysel manipülasyonlar için kolayca ucuz, mevcut erken aşamalarında şeffaf ve erişilebilir. Ayrıca, bu tür kalp ve beyin oluşumu, gastrulasyon, nörülasyon ve somitogenesis 15 gibi erken morfogenetik olaylar sırasında neredeyse düz bir geometriye sahiptir.

bu tür time-lapse görüntüleri satın alma yoluyla olduğu gibi, dinamik okudu eğer morfogenetik süreçler iyi anlaşılabilir. Civciv embriyo ovo 16 ama deneysel manipülasyonlar ve iletim ışık mikroskobu görüntüleme için sınırlı görüş için kötü erişilebilirlik ile görüntülendi olabilir. Bu nedenle, sever19 veya eksplant kültürleri 1,20 olarak – – 23 el teknikleri ex ovo, ya bütün sarısı kültür sistemlerinde 13,17 kültür civciv embriyolar öne sürülmüştür. Bütün sarısı kültür sistemlerinde, embriyo sağlam sarısı üzerinde kalır ve yumurta tüm içeriği inkübasyon için başka bir kaba aktarılır. Bu kap bir taşıyıcı yumurta kabuk 17, bir petri çanağı 19, ya da plastik sarılmak sargı 13,18 yapılmış bir hamak olabilir. Bütün sarısı kültürlerinde Embriyolar ideal kuluçka kadar kültüre ve micromanipulations erişilebilir olabilir. Bu teknikler, genç embriyo görselleştirmek için sabit kalırken, (kontrastını arttırır) kan dolaşımının başlandıktan sonra embriyo gelişimini incelemek için özellikle yararlıdır. Onlar sarısından çıkarıldı ve in vitro eksplant olarak kültüre eğer bu erken dönem embriyolarının en iyi görüntülü olabilir. eksplantlar deney için kolayca erişilebilirEl manipülasyonlar ve kültür için daha az yer gerektirir. Uzun yıllar boyunca, 1955 ve varyasyonları Denis Yeni öncülük ettiği bir tekniktir ve böylece time-lapse mikroskopi ve mikrocerrahi müdahalelerde 20,21 embriyo erişilebilir hale civciv embriyoları için eksplant kültürü yöntemleri altın standartları vardı. onun büyük başarısına rağmen, New'in teknik nispeten zorlu ve zaman alıcıdır. Blastodermin taşıyan Vitellin membran, uygun gerilimi 1 elde etmek için, bir cam halka etrafında gerildiğinde blastoderm genellikle ayırır. Dahası, embriyo ventral yüzü yukarı bakacak şekilde sadece kültüre edilebilir. AT (Erken civciv) kültürü, Chapman ve Collignon 1 tarafından geliştirilen daha yeni bir teknik, merkezi bir açıklığı olan bir filtre kağıdı taşıyıcı kullanılarak Vitellin zarın gerilmesi aşılmaktadır. Filtre kağıdı ve böylece doğal gerilimi muhafaza, vitellin membran bağlanır ve bir resim çerçevesi 1 gibi embriyo çevreler.Embriyolar genellikle ventral yüzü yukarı gelecek şekilde, bir agar-ak alt kültürlenir. Sırt tarafı yukarı Kültürleme HH8 15 yaş ve üstü embriyo için sadece mümkün görünmektedir. Birçok grup bu tür cerrahi dikiş lifleri 24 veya zar 25 kaplanmış bir kollajen yapılmış bir destek ile agar-ak dibe değiştirerek olarak ihtiyaçlarına filtre kağıdı taşıyıcı adapte var. Genellikle, New'in tekniği ile veya EC kültürü ile kültür embriyolar oksijen difüzyonunu 1,20 kolaylaştırmak için havaya onların dorsal veya ventral yüzeyi ile, maruz kalmaktadır. Bu eksplant kültürleri, ortam buharlaşmasını önlemek ve kurumasını embriyo önlemek için nemli bir atmosferde muhafaza edilmesi gerekir. Bu nemli kağıt mendil 1 ihtiva eden daha büyük bir Petri kabındaki eksplant kültürü ile çanak inkübe edilmesi ile elde edilir. Bu embriyoların zaman atlamalı görüntülerin elde edilmesi, tüm mikroskop ya da bir kıvama etrafında iklim kontrollü inkübatör kullanılmasını da gerektirirçalıçtırdıgınızda kontrollü ışık yolu 14 yoğunlaşmayı önlemek için ısıtılmış bir kapaklı konteyner. Tamamen, filtre kağıdı kültürleri 25 olarak kültür ortamında batık New'in tekniği 2,21 arasında adaptions ağır mineral yağ ve albümin bir tabaka arasında sıkışmış, ya da "Cornish Pasty Kültür katlanmış blastoderm eksplant olarak ovo Ancak civciv embriyolar da eski gelişebilir "23,26, hava ile doğrudan temas olmadan.

batık filtre kağıdı sandviç filtre kağıdı taşıyıcı tekniğinin yeni bir çeşididir. Civciv embriyolar ex ovo kültüre daha erken bilgi birleştirerek, iklim kontrollü inkübatör ve vazgeçilebilir ısıtmalı kapak yapar. Içeren kontrollü bir sıcaklıkta Embriyo iki aynı (lazer kesim) filtre kağıdı taşıyıcılar 24 ve kültürlendi, tam (2 oranında bir 3 Pannett-Compton tuzlu su 27,28 ince albümin) basit bir kültür ortamı içinde su altı arasında sandviçer. Ortamın üstünde yüzen hafif mineral yağ tabakası buharlaşma 2,21 önler ve çevreye ısı kaybını en aza indirir. kabın alt cam pencere vardır ve tüm kurulum dik uzun çalışma mesafesi zum mikroskop üzerinde gerçekleştirilir. Hamburger Hamilton bu kurulum 28-hücre gruplarının sahne erken ilkel çizgi aşamasından değişen embriyonik gelişim yaklaşık 30 saat yüksek çözünürlüklü aydınlık ve karanlık alan time-lapse film edinilmesini izin verir (eşdeğer 16, HH5-16 için 5 aşamalarını ) 15. Embriyolar kendi ventral ya da dorsal yüzü yukarı bakacak şekilde eşit derecede iyi kültüre edilebilir. (- 5, ve erken beynin 9-13, örneğin geç gastrulasyon 2, nöral tüp kapanma 3) geliştirme nedenle, embriyolar gözlem ve ventral (örneğin, erken kalp 7,8 ve somitogenesis 6) ve dorsal manipülasyonu için erişilebilir. batık filtre kağıdı sandviç pmikro boncuk implantasyonu, mikro enjeksiyon, gen susturma ve elektroporasyon çalışmaları için basit ve kararlı bir ortam rovides. Onun görüntüleme potansiyeli ve daldırma hedefleri (ışık-sac mikroskopi dahil) lazer tabanlı görüntüleme kullanarak çok daha fazla itilebilir.

Protocol

Tüm deney prosedürleri Hayvanlar Yasası üzerinde Hollanda Deneyleri göre yapılmıştır. NOT: batık filtre kağıdı sandviç yöntemi 1'den değiştirilir. 1. Batık Filtre Kağıdı Sandviç Hazırlama Pannett-Compton (PC) -tuz 27,28 Stok çözeltileri A hazırlayın (ultra saf H 1 L 2 O, NaCI 121 gr, KCl 15.5 gr, CaCI2 · H 2 O 10.42 gr ve 12.7 MgCl2 g · 6H 2 O) ve B (1 L ultra saf H2O, 2.365 gr Na 2 HPO 4 · 2H 2, O, ve NaH 2 PO 4 0.188 gr · 2H 2 O), temiz 1 L'lik şişe. 4 ° C'de saklayın. (Çökelmesini önlemek için bu sırayla) stok çözeltisi B 40 stok çözeltisi ilave edildi ve 60 ml ultra saf H2O 900 ml karıştırılarak PC-salin 1 L hazırlayın. PC-tuzlu taze fr hazırlayınom stok solüsyonları A ve B her hafta. Not: Stok çözeltiler birkaç ay boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. Otoklavlama ve / veya ekleme, antibiyotikler veya antimiyotikler gerekli değildir. Döllenmiş tavuk yumurtası kuluçka nemlendirilmiş bir inkübatör, kendi tarafında yumurtalarını ve istenilen yaşa gelinceye kadar 37.5 ° C onları kuluçkaya yatmaktadır. NOT: Mağaza yumurta artık iki hafta daha (tercihen 12 yaşında – 15 ° C) kuluçka anlamlı, deney öncesinde azalacak olarak Filtre kağıdı taşıyıcıları (1 uyarlanmıştır) Varsa, kalın filtrasyon kağıt (28 mm x 22 mm) kum saati şeklindeki filtre kağıdı taşıyıcıları kesmek için lazer kesme makinesi kullanın. 22 mm ile 10.4 mm arasında, orta genişliği gelmez. Filtre kağıdı taşıyıcının büyük yan (Şekil 1-M elips yönelik paralel uzun ekseni ile, merkezi bir eliptik açıklık (x 5.5 mm 10.6 mm) kesip). İsteğe bağlı olarak, doğru boyutlara sahip bir karton şablon hazırlamak ve bir kalem kullanarak kalın filtrasyon kağıda merkezi deliğinin onun anahat ve aktarın. ince makas kullanarak filtre kağıdı taşıyıcı kesin. Her embriyo Eksplante edilecek için iki özdeş filtre kağıdı taşıyıcıları kesin. Bir embriyo eksplantasyonu sırasında kaybolması durumunda yedek olarak ekstra filtre kağıdı taşıyıcıları hazırlayın. Sıcaklık kontrollü (Deney gününde) yağ banyosu dik zoom mikroskop motorlu xy-sahnenin merkezinde sıcaklık kontrollü behere koyun ve sıcaklık kontrol için beher bağlayın. ağırlık olarak hareket ve sıcaklık kontrollü beherin ortasına çanak yerleştirmek için 6 cm Petri kabı içine dört büyük paslanmaz çelikten halkalar (30 mm dış çapa, yüksekliği 4 mm, 1,5 mm duvar kalınlığı) koyun. NOT: Bu Petri kabı sadece petrol leve ayarlamak için bir yer tutucu olarak hizmet vermektedirl. hafif mineral yağ, 130 ml ısı kontrollü beher. Gerekirse, 6 cm Petri kabı üst kenarının altına yaklaşık 3 mm biter böylece eğer yağ seviyesini ayarlayın. sıcaklık kontrollü beher 6 santimetrelik bir petri tabağına çıkarın ve 40 ° C sıcaklığı ayarlamak. 2. Batık Filtre Kağıdı Sandwich Üretimi (Deney günü) kültür ortamı 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne (adım 1.1.2 1.1.1 gibi hazırlanan), PC-salin 30 mi dökün. Her iki embriyo eksplante edilecek PC-salin, 30 ml ile doldurulmuş bir 50 ml santrifüj tüpü hazırlayın. Dikkatlice 10 cm Petri kabı içine olmayan inkübe yumurta çatlak. Petri kabı duvarlar boyunca plastik bir transfer pipet hareket ve ince albümin de emerek ince albümin hasat. Her iki embriyo eksplante edilecek bir 50 ml santrifüj tüpü içinde 30 mi, ince albümin toplayın. Sadece t elde etmek için emin olunalbümin hin. NOT: Genellikle 3-4 yumurta, ince albümin yaklaşık 30 ml hasat verir. (Adım 2.1.1 gibi hazırlanan) her PC-tuzlu su içine ince bir albümin 20 ml dökün 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne doldurulmuş. nazikçe boruları birkaç kez ters yüz edilerek ince albümin PC-tuzlu su karıştırın. birkaç dakika yerleşmek ve burada itibaren kültür ortamı denilen karışım, berrak olup olmadığını kontrol edelim. Kültür ortamı değil açık ise, stok solüsyonu taze PC-tuzlu su hazırlamak ve taze ince albümin hasat. taze 6 cm'lik plastik Petri kabındaki kadar birbirlerinden mümkün iki küçük paslanmaz çelik halkalar (20 mm dış çapa, yüksekliği 4 mm, 1.5 mm duvar kalınlığı, halka içerisinde 6,5 mm boşluk) yerleştirin ve kültür 22 ml ile doldurun ortam, 25 ml plastik pipet (Şekil 1-H) kullanılarak (adım 1.4.4 1.4.1 gibi hazırlanan). orta üstünde biriken enkaz santrifüj tüpüne kalır emin olun. Herhangi bir enkaz o kaldırınr plastik transfer pipet kullanarak ortamdan kabarcıklar. PC-tuz 75 ml ile 10 santimetrelik bir petri tabağına doldurun (adım 2.15 kullanılmak üzere). inkübatör bir yumurta çıkarın ve embriyo sarısı üstüne gelmesine izin 1 dakika boyunca yan bankta dinlensin. Dikkatli bir şekilde Petri kabı içine yumurta (Şekil 1-A) çatlak. Kalın akı ince dokulu kağıt parçasının kenarı daldırın ve gerektiğinde, çekerek blastodermin merkezi. (Kalın albümin alımını kolaylaştırmak için kesilmiş ucu ile) plastik transfer pipet kullanarak Petri kabı ince ve kalın albümin en çıkarmak. Yavaşça, doku kağıt parçası ile kalın albümin silerek merkezine (Şekil 1-B) uzaklaşarak embriyo etrafında kalın akı bir pencere oluşturun. vitellin membran takılarak gelen kağıt mendil önleyin. cımbız kullanarak, dikkatle Vite bir filtre kağıdı taşıyıcı yerleştirinEmbriyo (Şekil 1-C) ön-arka eksenine eliptik diyafram paralel uzun ekseni ile embriyo yaklaşık lline membran. Filtre kağıdı taşıyıcıya yakın ve hızlı bir şekilde tüm filtre kağıdı taşıyıcı (Şekil 1-D) etrafında kesilmiş vitellin zarından tırnak makası bir ucu sıkıştırın. Cımbız kullanarak, embriyo (Şekil 1-E) ön-arka eksene eğik bir doğrultuda paralel olarak kaldı sarısından filtre kağıdı taşıyıcı kaldırın. üst embriyonun ventral tarafı var ve PC-tuzlu su içinde daldırın etrafında filtre kağıdı taşıyıcı çevirin. eğik bir doğrultuda embriyo ön-arka eksen boyunca filtre kağıdı taşıyıcı bırakın. tüm sarısı kurtulun hala vitellin membran ve yavaşça plastik bir transfer pipet PC-tuzlu su ile yıkayarak blastoderm bağlı. bir de batık filtre kağıdı taşıyıcı tamamını tutmakll kez (Şekil 1-F). eğik bir yönde embriyonun ön-arka eksen boyunca PC-tuzlu filtre kağıdı taşıyıcısını çıkarın ve bir kağıt mendil üzerine filtre kağıdı taşıyıcı kenarına dabbing aşırı sıvı kurtulmak. cımbız, ikinci bir çifti kullanılarak, yukarı bakacak şekilde embriyonun ventral yüzü yatay filtre kağıdı tutun ve birincinin üstüne başka bir filtre kağıdı taşıyıcısını yerleştirin. Bunların delikler ve böylece de filtre kağıdı, iki katman (Şekil 1-G) arasındaki embriyo sandviç, tam olarak aynı olmalıdır. Hemen embriyo ön-arka ekseni boyunca eğik bir doğrultuda kültür ortamına filtre kağıdı taşıyıcı sandviç daldırın. Iki çelik halkaları (Şekil 1 -H) arasındaki boşluğu saran alanına yerleştirin. emin olun, diğer ikisinin üstünde iki tane daha çelik halkalar koyarak filtre kağıdı sandviç düzeltmek o e diyaframmbryo tamamen (Şekil 1-I) ortaya kalır. orta seviyesini kontrol edin ve üst boşluk sadece orta batık olduğundan emin olun. Gerekirse, ekleme ya da ortam ile az miktardaki. Dikkatle sıcaklık kontrollü yağ banyosu merkezinde Petri kabı koyun ve yağ yemeğin yanında üç büyük paslanmaz çelik halkalar (30 mm dış çapı, yüksekliği 4 mm, 1,5 mm et kalınlığı) koyarak çanak yanal stabilize . Çelik halkalar çanak (Şekil 1-J) kenarlarına dokunduğundan emin olun. Orta mineral yağ sürekli bir tabaka (Şekil 1-K) ile kaplanmış, böylece yavaşça, plastik bir transfer pipeti ile ortam üzerine hafif mineral yağ, yaklaşık 6 ml pipetle. Time-lapse edinimi ayarlayın. NOT: Beş örtüşen alt görüntüleri (fayans) yatay manzaraları olarak embriyolar Görüntüleme genel overvi ile ayrıntılı görüntüleme (5X hedefi) izin verirmorfoloji 29-30 arasında ew. 3 ve 10 dakika arasında görüntüleme periyotları morfolojik ayrıntılı izleme için 31 ve küçük z yığınlarının elde etme (30 um'lik bir mesafe ile, beş ila yedi farklı uçak) embriyo 30 kalınlaşma ve dönme çok telafi sağlamak . En yüksek kontrasta sahip Z-uçakları (görüntü alımı ile ilgili detaylı bilgi için Temsilcisi Sonuçlar bölümüne bakınız) time-lapse film içine tek kare daha fazla işlem öncesi 32 seçilebilir. Şekil 1: Batık Filtre Kağıdı Sandviç kurma. (A), bir yumurta, bir Petri kabı içerisine termal olarak ayrılmaktadır. (B), kalın ve ince albümin çoğu plastik bir transfer pipeti ile Petri kabı çıkarılır (gösterilmiyor). Ardından, kalın ak bir pencere oluşturulan biryavaşça bir kağıt mendil ile kalın albümin uzakta silerek embriyo yuvarlak. (C) bir filtre kağıdı, taşıyıcı sarısı üstüne blastodermin etrafına yerleştirilir. (D), filtre kağıdı, taşıyıcı sarısı üstünden kaldırıldı Çevre vitellin membran ve (E) gevşek kesilir. (F) Kalan yumurta sarısı özenle PC-tuzlu su uzakta yıkanır. (G), embriyo, bir ikinci denk filtre kağıdı taşıyıcı ile sıkıştırılır. (H) filtre kağıdı sandviç ortamında batık ve (yukarı embriyo bakan dorsal veya ventral yüzü) iki metal paslanmaz çelik halkalar üzerinde konumlandırılmıştır. (I) İki yüzük üstten sandviç stabilize. (J), sıcaklık kontrollü yağ banyosuna aktarılır embriyolu Petri kabı. Paslanmaz çelik halkalar yanal Petri kabı stabilize. (K) kültür ortamına mineral yağ tabakası ile kaplanmıştır.Batık filtre sandviç (L) şematik. (M) batık filtre kağıdı sandviç için kullanılan filtre kağıdı taşıyıcıların boyutları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Representative Results

Şekil 2: AK Kültür 1 ve Dalgıç Filtre Kağıdı Sandviç Kültür Embriyolar arasındaki morfolojik karşılaştırılması. Seçilen zaman atlamalı çerçeveler 3 saat aralıklarla embriyolar göstermektedir. Çerçeveler tam embriyo morfolojisi genel bir bakış vermek için yeniden boyutlandırılır. Embriyolar 7-hücre gruplarının evre (HH9) 15 yaş uyumlu bulundu. 0 saat, her deney başlangıcını gösterir. Ön sol her zaman. Görüntüler karanlık alan aydınlatma kullanılarak elde edildi. 1,33 alt agar-albümin EC kültürü 1, kültürlü ventral yüzü yukarı (A) Embriyo. Embriyo z-yönünde sınırlı olarak yüksek kaliteli görüntü, elde edilebilir. (B ve C) batık filtre kağıdı sandviç kültüre İki embriyolar: (B) yukarı ventral tarafı ve (C) sırt tarafı yukarı.Filtre kağıdı sandviç Embriyolar en az 27 saat süreyle nitel farklılıklar olmadan gelişebilir. Onlar fonksiyonel kan dolaşımı ve kranial ve servikal bükülmesine geliştirmek ve başarılı bir şekilde çevirin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Time-lapse edinimi mevcut mikroskop sistemine bağlıdır. Bu çalışmada, uzun bir çalışma mesafesi içinde, dik zoom mikroskop kullanıldı. yakınlaştırma faktörü 5X için kuruldu. Mercek 16X büyütme ile birlikte, bu (mikroskop yazılımı belirtildiği gibi) 1.3 mm / piksel teorik çözünürlüğü 30, 80X toplam büyütme sonuçlandı. alan-view arttırmak için, embriyolar beş alt görüntüleri (fayans) yatay manzaraları olarak görüntülendi. Bu nedenle, beş örtüşen çini oluşan bir çini bölgesi, 29 tanımlandı. Bu karo bölgesitam olarak yatay uzantı (- 0 saat Şekil 2B) filtre kağıdı taşıyıcının eliptik açıklığı kapsayacak şekilde yerleştirilmiştir. Her kiremit yaklaşık 2.7 mm'lik bir alan-of-view kapsayan 2.048 x 2.048 piksel boyutu vardı ve fayans sonuçlanan% 10 örtüşme ile elde edildi saha-view yaklaşık 12 mm x 2.7 mm toplam panorama. Motorlu xy aşamalı ayrı karoların 29 edinimi arasında yaklaşık 1.75 mm / sn hızında amaca göre hareket. Canlı görüntü ön presomitic mezoderm ve en yakın zamanda oluşmuş Somitlerin (Grubumuzun araştırma odağı) üzerinde duruldu. Z-doğrultusunda embriyoların kalınlaşma ve kıvırma telafi etmek için, küçük bir Z-yığınlarının (30 um'lik bir mesafe ile, beş ila yedi farklı uçak), her bir zaman noktasında 30 elde edildi. Bunlar presomitic mezodermin ön ucu odak düzlemi etrafında seçildi. Zaman atlamalı ACQ süresiuisition 50 saat için ayarlandı ve 3, 4, veya 10 dakika görüntüleme periyotları 31 seçilmiştir. 10 saat ve yeni optimum odak düzlemi etrafında z-yığını yeniden tanımlıyor – time-lapse edinimi kalitesi her 5 refocusing ile geliştirilebilir. Deney sonunda, bütün zaman serisi elle düzenlendi ve en iyi odak z-düzlemi içeren görüntülerin alt grupları oluşturulur ve ayrı bir klasöre 32 kaydedildi. Görüntülerin Bu alt kümeler zaman dikişli optimum odak görüntülerin tam bir zaman serisi oluşturmak için vardı. Bu tam bir zaman serisi her görüntünün fayans dikişli ve gölgeleme düzeltme 30 olmadan kaynaşarak ve zaman atlamalı çerçeveleri% 100 büyüklüğü ve% 95 sıkıştırma 32 JPEG görüntüleri olarak ihraç edildi bulundu. Time-lapse çerçeveleri profesyonel video düzenleme yazılımı içine bir görüntü dizisi olarak ithal edildi. Ayrıntılı% 100 yakınlaştırır stabilize edilmiş ve genel kontrast bizim sevme ayarlandı. Nihai zaman ihmaller kodlamak vardıH.264 codec d ve MPEG-4 konteyner ihraç etti. Filmler 15 kare / sn (fps) ve 1.920 x 1.080 piksel çözünürlükte bir kare hızında görüntülenir. Şekil 2 EC kültür 1 (Şekil 2A) embriyo ve batık filtre kağıdı sandviç kültürü iki embriyolar, bir varlık kültürlü ventral yüzü yukarı (Şekil 2B) ve diğeri dorsal tarafına kadar (Şekil 2C) arasında bir karşılaştırma gösterir. Tüm embriyo aynı yaştaki yedi hücre gruplarının aşama (HH9) 15 ve 4 dakika (Şekil 2A ve B) ya da 10 dakika (Şekil 2C) bir zamansal çözünürlüğü ile görüntülendi. 3 saat aralıklarla seçilen kareler tasvir edilmektedir. AK kültürü (Şekil 2A) nedeniyle 1,33 alt istikrarlı bir agar-albümin dayanan embriyo çok kararlı görüntüleme izin verdi. Tüm embriyo t boyunca bir odak düzlemi kaldıo bütün zaman atlamalı. Bu kısa deneyler (birkaç saat) ve çok erken embriyolar için yararlı olabilir, ama muhtemelen uzun vadede başarılı üç boyutlu gelişimini engelleyen z-yönünde embriyo, güçlü bir hapis ile birlikte geliyor. Başlangıçta, hapsetme sadece ventral yüzü yukarı (0 saatte Şekil 2A ve 2B karşılaştırın) ile batık filtre kağıdı sandviç kültüre bir embriyo ile karşılaştırıldığında embriyonun kafasının hafif yanal düzleşme sonuçlandı. Daha sonra, baş dönüm (Şekil 2A – 21 saat) engelli ve kalp atışları yavaşladı. Kan dolaşımı neredeyse durdu. AK kültüründe embriyonun tam time-lapse için ek Movie 1 Bkz. sol alt paneli tam çözünürlükte kalp gelişimini görüntüler ise bu filmde üst panel, embriyo tam bir özetini göstermektedir. Somitlerin içine presomitic mezodermin segmentasyon se olabilirAlt sağdaki ayrıntılı olarak tr. batırılmış filtre kağıdı sandviç Embriyolar, diğer yandan, sadece bunları çevreleyen zarların doğal gerilim ile, üç boyutlu bir genişleme sınırlıydı. Bunlar ventral (Şekil 2B) ya da dorsal tarafına kadar (Şekil 2C) ile ya da kültür olabilir. Her iki durumda da, embriyolar sürekli somitogenesis gösterdi ve onların başları döndü. Bu kafa ve boyun eğme ve fonksiyonel kan dolaşımını geliştirdi. Başın parçaları yavaş yavaş mezodermin segmentlere kısmı odak kalırken embriyolar, büyüdü kalınlaşmış ve dönmeye başladı olarak odak dışına böylece filtre kağıdı sandviç Her iki embriyolar, bölümleme mezodermin odaklanarak görüntülendi (21 saat 27 saatte Şekil 2B ve 2C karşılaştırın). Ek Film 2 tasvir embriyonun tam time-lapse film gösterirŞekil 2B. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. Bu filmin üst panel embriyo tam bir bakış gösterir. Embriyonun gelişimi nedeniyle genel kalınlaşma ve embriyonik doku dönüm ardışık üzerinde 46 saat görüntülendi, ama yaklaşık 30 saat sonra, bölümleme mezodermin odak kayboldu. Sol alt panel edinilen time-lapse kare tam çözünürlükte kalbin erken gelişim gösterir. orta hatta her iki tarafında eşleştirilmiş kardiyak primordia füzyonu ile, hemen hemen düz bir boru biçimindeki bir yapı, daha sonra dayak ve sağa doğru eğilmeye başlar ki, meydana getirilir. Sağ alt paneli en son oluşmuş somitler ve tam çözünürlükte presomitic mezodermin ön ucu gösterir ve zamanla yeni Somitlerin oluşumunu izler. Ek Film 3 kültüre başka embriyo gösterir ve batık filtre kağıdı sandviç yukarı ventral tarafı görüntülenmiş. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. Film th kapsarevre HH5-6 yaklaşık embriyonun e gelişimi, HH14 15 kültür süresi boyunca yaklaşık 27 saat sahne. Baş formları kat ve posterior ilerler. ikili primordiasında kalp şekilleri, dayak ve sağa eğilir başlar. ilk üç ile dört Somitlerin eş zamanlı olarak oluşturur. Ek Somitlerin presomitic mezodermin ön ucundan sırayla kapalı tomurcuk. alt panel yüksek detaylı baş kat ve erken kalp oluşumu gözlem izin tam çözünürlükte embriyonun baş bölgesini göstermektedir. Nedeniyle embriyonun şeffaflık, nöral tüpün kapanması gelecek kafa bölgesinde görülebilir. Alt panelde tam görüntüleme zamanla tam çözünürlükte aynı embriyoda Ek Film 4 görüntüler hücre gruplarının oluşumu. Ek Film 5 embriyo kültüre sırt tarafı yukarı (Şekil 2C) tam time-lapse gösterir. Görüntüleme aralığı 10 dk oldu. upp ikener paneli yaklaşık sahneye HH16-17 yedi hücre gruplarının aşamada (HH9) embriyo gelişimini gösterir, alt panel tam çözünürlükte bu aşamada erken beyinde morfolojik değişiklikleri görüntülemek için kırpılır. Nöral tüpün yerel şişlik daha sonra 13 aşamaları embriyonik beyin beş alt bölgelere bölmek olacaktır ön beyin, orta beyin ve Beyin ve bölgeselleşme, yol izlenebilir. Buna ek olarak, optik veziküllerin büyümesi açıkça görülebilir. kültüründe yaklaşık 30 saat sonra, embriyo ölüyor. mikrocerrahi manipülasyonlar ile su altında filtre kağıdı sandviç uyumluluk birkaç polistiren mikro-göstermek için (~ çapı 40 um) içine veya daldırılmış filtre kağıdı sandviç kültürünün bir tavuk embriyo presomitic mezoderm yakın yerleştirildi. mikro-saklama tamponu ve implan uzaklaştırmak için PBS içinde yıkandıted önce hafif mineral yağ tabakası ile kültür ortamının kapsayan (protokol bölümünün 2.18 adıma karşılaştırın). Bir cam Pasteur pipet mikroskop göz mercekleri ile gözlem altında, embriyo yüzeyine boncuk transferi için kullanılmıştır. Beş delik yavaşça bir akupunktur iğnesi ile kazıyarak endoderm yaratılmıştır. germe ve bir alev bir cam Pasteur pipeti bükme tarafından oluşturulan bir ısmarlama J-şekilli araç, boncuk işlemek ve onlar hareketsiz hale gelene kadar deliklere dikkatle itmek için kullanılmıştır. Üç delikli bir tanesi, her bir ile doldurulmuştur (Şekil 3A – 0 saat ve 3B *) ve iki boncuk her biri için (Şekil 3A – 0 saat), iki delik açın. Şekil 3a, seçilen zaman atlamalı dilimlerinde, tanelerin mikro implantasyondan sonra civciv embriyo gelişimi. Üç takviye kanadının başarılı bir şekilde istenen konuma dokusuna dahil edilmiştir, ve hareketleri boyunca görüntülenmiştiryüksek detay (Şekil 3B) deney ders. Embriyonun gelişimi manipülasyon ya da boncukların varlığı ile değer düşüklüğüne görünmüyordu. Tam time-lapse film için Yan Sinema 6'ya bakınız. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. Şekil 3: microbead İmplantasyonu sonra Time-lapse Görüntüleme. Proof-of-prensibi deney microbead implantasyonu ile batık filtre kağıdı sandviç uyumluluk gösteren. Embriyonun başı solunda, ancak, bu deney sırasında görüntüsü değildi. Görüntüler karanlık alan aydınlatma kullanılarak elde edildi. (A) Seçilen time-lapse yedi mikroboncuk implantasyonu sonrası 3 saat aralıklarla manipüle embriyo gösteren çerçeveleri (~ 40 mikron çapında). Sürekli uzatılmış ve embriyo ilave somit oluşturulanes. Üç boncuk düzgün bağlanmış ve kültür 18 saat içinde doku akışı ile medial taşınmış gibi görünüyor. Diğer dört boncuk 6 ila 9 deliklerinden dışarı kültürünün hr attı ve posterior sürüklendi. Deneyin başında (0 saat, B *) ve inkübasyon 12 saat sonra (B **) de presomitic mezoderm içine implante (B) üç tek boncuk Ayrıntılı görünüm (B3 B1). Sadece oluşturan Somitlerin sayısı (B B * daki S9 ve S18 **) belirtilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Ek Film 1: AT-kültür ventral Side Up. Yedi hücre gruplarının sahneye itibaren bir agar-ak botto üzerinde (HH9) 15 1, kültürlü ventral yüzü yukarı AK kültüründe Embriyo,m 1,33. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. göreli zaman sol üst köşesinde görüntülenir. Embriyo z-doğrultusunda sınırlı olduğu gibi yüksek kaliteli görüntüler, kazanılmış olabilir. 21 saat sonra, kalp atışı ve kan akımı neredeyse tutuklandı ve embriyo parçalamak başlamıştı. alt paneller tam çözünürlükte (% 100 yakınlaştırma) 'de presomitic mezoderm (sağ panel) kalp gelişimini (sol panel) ve segmentasyon görselleştirmek ederken üst panel, embriyo bir yeniden boyutlandırılmış özetini göstermektedir. (Sağ indirmek için tıklayın). Ek Film 2: Batık Filtre Kağıdı Sandviç ventral Side Up. Yedi hücre gruplarının aşamasında (HH9) 15 itibaren, ventral sid gelen batık kağıt sandviç kültüre embriyoe yukarı bakacak. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. göreli zaman 24 saat sonra yeniden başlatmayı, saat ve dakika olarak sol üst köşesinde görüntülenir. üst panel arka arkaya, 46 saat boyunca embriyonun gelişiminin yeniden boyutlandırılmış özetini göstermektedir. Sol alt panel tam çözünürlükte (% 100 zoom) görüntü alımı ilk 10 saat boyunca erken kalp gelişimini görüntüler. Sağ alt paneli odak nedeniyle genel kalınlaşma ve embriyonik doku dönüm kaybetti kadar tam çözünürlükte (% 100 zoom) gelişme yaklaşık 30 saat boyunca mezoderm segmentlere betimlediği. (Sağ indirmek için tıklayın). Ek Film 3: Baş Katlama oluşumu. dan batık filtre kağıdı sandviç Embriyo kültür ventral yüzü yukarı oreklam süreç / kafa kat aşaması (HH5-6) 15 yaklaşık 22 hücre gruplarının sahne (HH14) kültür süresi 15 yılı aşkın kabaca 27 saat. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. göreli zaman 24 saat sonra yeniden başlatmayı, saat ve dakika olarak sol üst köşesinde görüntülenir. üst panel embriyonun gelişiminin yeniden boyutlandırılmış özetini göstermektedir. alt panel tam çözünürlükte (% 100 zoom) embriyonun baş bölgesini göstermektedir. Baş kat ve erken kalp ve nöral tüp kapanması oluşumu görülebilir. (Sağ indirmek için tıklayın). Ek Film 4: Somitogenesis. Baş-işlem / kafa kat aşamada (HH5-6) den batık filtre kağıdı sandviç Embriyo kültür ventral yüzü yukarı 15Yaklaşık 22-hücre gruplarının evre (HH14) kültür süresi 15 yılı aşkın kabaca 27 saat için. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. göreli zaman 24 saat sonra yeniden başlatmayı, saat ve dakika olarak sol üst köşesinde görüntülenir. üst panel embriyonun gelişiminin yeniden boyutlandırılmış özetini göstermektedir. alt panel tam çözünürlükte (% 100 yakınlaştırma) 'de segmentlere paraxial mezoderm göstermektedir. (Sağ indirmek için tıklayın). Ek Film 5: Batık Filtre Kağıdı Sandviç Sırt Side Up. Yaklaşık HH16-17 sahneye 15 yedi hücre gruplarının aşamada (HH9) 15 dan batık filtre kağıdı sandviç Embriyo kültür dorsal yüzü yukarı. Görüntüleme aralığı 10 dk oldu. göreli zaman görüntülenirsaat ve dakika içinde sol üst köşesinde, 24 saat sonra yeniden başlatmayı. üst panel embriyonun gelişiminin yeniden boyutlandırılmış özetini göstermektedir. alt panel tam çözünürlükte (% 100 yakınlaştırma) erken beyinde morfolojik değişiklikler göstermektedir. embriyo kültüründe yaklaşık 30 saat sonra öldü. (Sağ indirmek için tıklayın). Ek Film 6: microbeads İmplante. Dokuz hücre gruplarının aşamada (HH9-10) 15 başlayarak yaklaşık 19 saat için batık filtre kağıdı sandviç Embriyo kültür ventral yüzü yukarı. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. göreli zaman h ve min sol üst köşesinde görüntülenir. Yedi mikroboncuklarının pr içine implante ile üst panel kuyruk bölgenin yeniden boyutlandırılmış genel bakışını gösteriresomitic mezoderm. alt panel tam çözünürlükte (% 100 yakınlaştırma) implante mikro boncuklar ile bölgeyi gösterir. (Sağ indirmek için tıklayın).

Discussion

Köklü AK kültürü 1 yeni varyantı olarak, batık filtre kağıdı sandviç etrafında bir ısıya ve nem kontrollü inkübatör yaparak erken civciv embriyosu ex uzun vadeli aydınlık ve karanlık alan time-lapse film satın ovo kolaylaştırır vazgeçilebilir mikroskop. Daha ziyade, bir yan-katı agar ak alt kültüre edildikten daha embriyolar tam PC-tuzlu su ve ince albümin oluşan basit kültür ortamı içine daldırılmış olarak saklanmaktadır. Buharlaştırma ve ısı kaybı kültür ortamının üstte yüzen bir mineral yağ tabakası ile en aza indirgenmiştir. Embriyolar kalitesinde gözle görülür farklılıklar olmadan, kolayca dorsal veya ventral yüzü yukarı ya yetiştirilebilir. Burada gösterildiği gibi, batık filtre kağıdı sandviç embriyolar morfojen batırılmış boncuklar uygulaması gibi, mikrocerrahi girişimlere erişilebilir. Gelecekteki uygulamalar ma susturma canlı floresan görüntüleme, microinjections ve elektroporasyon ve geni içerennipulate ve ventral (örneğin, erken kalp ve somitogenesis) ve dorsal (örneğin, geç gastrulasyon, nöral tüp kapanma ve erken beyin) gelişimi sırasında morfogenetik olaylar geniş bir yelpazede çalışma. Filtre kağıdı sandviç içeren Petri kabı madeni yağ tabakasının altında kültür ortamının değişimi sağlayan bir perfüzyon odasının değiştirilmesi durumunda bir zamana bağlı ilaç tedavisi uygulanabilir. batık filtre kağıdı sandviç ve daldırma hedefleri (ışık sayfalık mikroskobu dahil) lazer tabanlı görüntüleme ile birlikte tam görüntüleme potansiyelini geliştirecek.

batık filtre kağıdı sandviç hazırlama ile bazı güçlükler aşağıdaki paragraflarda ele alınacaktır. bu filtre kağıdı sandviç sarısından bir embriyo transfer eğitim sadece ılımlı bir miktar gerektirmekle birlikte, birkaç adım hala önemli ölçüde kültüründe embriyo kalitesini etkileyebilir. Filtre kağıdı taşıyıcı öncesarısı üzerine yerleştirilir, embriyo etrafında Vitellin zar herhangi bir kalın akı kurtulmuş olmalıdır. Ancak o zaman filtre kağıdı ve vitellin membran arasındaki bağlantı PC-tuzlu su içinde yıkamaya dayanacak kadar güçlü olacaktır. Mümkün olduğunca az sıvı / hava arayüzü geçmelidir embriyo taşıyan filtre kağıdı zarlar üzerinde gerginliği en aza indirmek için. Yıkama PC-tuzlu getirilen kez, tüm filtre kağıdı taşıyıcı tamamen her zaman batık kalmak zorundadır. Vitellin membran filtre kağıdı serbest başlayacak şekilde, 60 saniye – PC-tuz banyosu içinde süresi yaklaşık 30 ile sınırlı olmalıdır. sarısı kalıntıları daha sonra embriyonun görünümü belirsiz gibi hala, embriyonun temizleme, çok iyice idam edilmelidir. yıkama sırasında, radyal ondan her zaman doğrudan embriyo üzerine transfer pipeti akışı işaret ama olmadı. PC-tuzlu embriyo çıkardıktan sonra, en aza indirmek için yatay filtre kağıdı tutmak emin olunembriyonik zarlar üzerinde gerginlik. Sonra, ikinci filtre kağıdı taşıyıcı ile embriyo stabilize. İkinci filtre kağıdı taşıyıcı yerleştirilir sonra, birbirlerine göre filtre kağıdı taşıyıcıları vardiya ve embriyonik membranlar gözyaşı herhangi bir yanal gerginlik, oluşturmaktan kaçının. Filtre kağıdı sandviç kültür ortamına getirildiğinde, membranların gerilimi en aza indirmek için, sadece bir kez hava / su ara-yüzünün geçmelidir. Üstten filtre kağıdı sandviç stabilize etmek için kullanılan paslanmaz çelik halkalar ikinci çift çok yavaş yerleştirilir ve embriyonik zarların sıkıştırma en aza indirmek için herhangi bir baskı olmadan yapılmalıdır. Embriyonun alan Opaca Küçük yırtıkları genellikle kültürün ilk saat içinde iyileşir, ancak yağ tabakası kültür ortamının üstüne pipetle önce hasarlı embriyo ve her zaman yeni bir numune ile değiştirilmesi gerektiğini olabilir.

Resme bir bütün embriyo ya da yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı filmleri için çoklu numuneler, mikrofonroscope mikroskop yazılımı tarafından kontrol edilen bir motorlu xy sahne, ile donatılmış olmalıdır. Bu görüntü kalitesini azaltacaktır kültür ortamında ve yağda embriyolar ve çalkantılar, zarar görmesini önlemek için bir asgari hız ile xy aşamalı hareket olması büyük önem taşımaktadır. Burada sunulan time-lapse film alımı için, motorlu xy aşamalı yaklaşık 1.75 mm / sn hızında taşındı. Gelecekte, görüntüleme ayrıca birinci istenen pozisyona sahne hareketli ve titreşimler ve türbülanslar kaybolup izin kısa dinlenme süresinden sonra görüntüyü alarak geliştirilebilir.

daldırma hedefleri olmadan dik mikroskop kullanılması durumunda bir sınırlama olarak, potansiyel kullanıcılar bu kültür yöntemi için gerekli nispeten uzun çalışma mesafesi (yaklaşık 1 cm) farkında olmalıdır. Embriyonun üzerine orta tabakası ve mineral yağ bu çalışma mesafesi oluşur. 6 santimetrelik bir petri tabağına, yağ tabakası kalınlıkta olanYaklaşık 1 S – 1.5 mm, ve embriyo kültür ortamında derinliği yaklaşık 4 mm batırıldı. objektif çapına bağlı olarak, 6 cm Petri kabı üst kenarı da embriyo erişimi sınırlayabilir. Bu daha büyük bir çanak kullanılarak aşılabilir.

üst çalışma mesafesi hafif sıvı tabakaların kalınlıkları en aza indirerek azaltılabilir. Buna ek olarak, aşağıdaki çalışma mesafesi daha aşağı Petri kabı alt embriyo getiren ve ısıtılmış beher camın kalınlığının azaltılması ile minimize edilebilir. protokol dik uzun çalışma mesafesi zoom mikroskop ile çalışmak üzere optimize edilmiş olsa da, aynı zamanda ters bir mikroskop monte edilebilir. Ön deneyler sınırlı difüzyon bir prob olarak görünmüyor düşündürmektedir rağmen gelecek kullanıcılar, kültür ortamı içinde çok derinden embriyo daldırarak O 2 -diffusion sorunları yol açabileceği akılda tutulmalıdırlem sürece embriyo kültür ortamı ve sıkıştırılmış filtre kağıdı yeterince geniş rezervuar tarafından çevrelenmiş olarak Petri kabı alt basılı değildir.

Başka bir sınırlama sıcaklık kontrolü. 40 ° C'ye kadar ısıtıldı beher için kontrol sıcaklığının ayarlanması ile, orta sıcaklık ortamı mineral yağ ile kaplanmıştır embriyoların yaklaşık 37.5 ° C dengeler. Bu, bazı enerji ısıtma elemanları ve sıcaklık sensörü bulunan beher, alt ve embriyo arasında yer kayıp olduğunu gösterir. sıcaklık kontrol sensörü taşındıktan ve ısıtma elemanları dağıtarak optimize edilebilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar ZonMW-VICI hibe 918.11.635 (Hollanda) mali destek kabul. Yazarlar pratik öneriler ve mikroskopi yararlı tavsiyeler kurulum bileşenleri ve Carl Zeiss Hollanda Jarno Voortman üretimi için Vrije Universiteit Amsterdam aracı dükkanı teşekkür etmek istiyorum. Marjolein Blaauboer eleştirel yazının birkaç taslak üzerinde yorum büyük bir destek oldu.

Materials

Milli-Q Reference Water Purification System Millipore Z00QSV0WW 
Duran laboratory bottles, with caps, 1L Sigma-Aldrich/Duran Z305200-10EA 
Name Company Catalog Number Comments
Solution A
NaCl Merck Millipore 1064041000
KCl Merck Millipore 1049361000
CaCl2 H2O Merck Millipore 1023821000
MgCl2.6H2O Merck/Sigma-Aldrich 13152-1KG-D 
Name Company Catalog Number Comments
Solution B
Na2HPO4.2H2O Merck 1065801000
NaH2PO4.2H2O Merck 1063420250
Name Company Catalog Number Comments
Whatman qualitative filter paper, Grade 595 Sigma-Aldrich 10311611
Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130W, wavelength 10.6 µm Micro Lasersystems
Tork Extra Soft Facial Tissues Tork 140280
Latex gloves Sigma-Aldrich Z645613
EMDAMED EMDA 300.131
Transfer pipettes Sigma-Aldrich Z350613
VWR WITG5.480.003
accu-jet pro Pipette Controller BrandTech Scientific 26332
Serological plastic pipettes, 25mL Sigma-Aldrich CLS4251
Plastic document sleeves
Egg incubator – Incubator mod. Cip Cip 40 Fiem
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) Drost BV (Loosdrecht, NL)
10 cm Tissue culture dishes Sigma-Aldrich P5731
Greiner Bio-one 664160
6 cm Petri dishes Sigma-Aldrich P5481
50ml Centrifuge tubes , Greiner centrifuge tubes  or Cellstar tubes Sigma-Aldrich T2318
greiner bio-one 227261
Name Company Catalog Number Comments
Stainless steel rings, custom-made
Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness
Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring
Nail scissors
Forceps, Dumont #5, Inox Fine Science Tools , F.S.T. 11251-20
Fine, really sharp scissors for cutting filter paper VWR 21-102
M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil Sigma-Aldrich CAS Number 8042-47-5
Name Company Catalog Number Comments
Agar bottoms for EC culture
Agarose Sigma-Aldrich A9539 SIGMA
NaCl Sigma-Aldrich S7653 SIGMA-ALDRICH
Name Company Catalog Number Comments
Microbead implantation
Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) Polysciences, Inc. 16905-1
Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30mm SEIRIN  type J, No.02, 0.12x30mm
PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023 
Name Company Catalog Number Comments
Temperature controlled beaker
RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M Omega RTD-850M
Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M Omega HSRTD-3-100-A-1M
Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 Omega EXTT-3CU-26S-50
3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M Omega MTP-U-M
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P Omega KHLV-103/(10)-P
Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC Omega CNi16D24-C4EIT-DC
Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)
Name Company Catalog Number Comments
Microscope setup
Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN Carl Zeiss AG 495010-0009-000
Objective PlanNeoFluar Z 1.0x/0.25 FWD 56mm Carl Zeiss AG 435281-9100-000
Manual Rotary Control MARC Carl Zeiss AG 435604-0000-000
Transillumination top 450 mot Carl Zeiss AG 435500-9000-000
Motorized measuring stage S 150×100 mot; CAN (D) Carl Zeiss AG 435465-9020-000
Insert plate S, glass 237x157x3mm (D) Carl Zeiss AG 435465-9053-000
Controller EMS 3 Carl Zeiss AG 435610-9010-000
System Control Panel SYCOP 3 Carl Zeiss AG 435611-9010-000
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera Hamamatsu C11440-22CU
Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual Carl Zeiss AG 490004-0025-000
Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US Carl Zeiss AG 410373-0200-000
LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" Carl Zeiss AG 410350-2403-000 not available anymore
ZEN pro 2012 Hardware License key Carl Zeiss AG 410135-1002-120 not available anymore
ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key Carl Zeiss AG 410136-1045-110
ZEN module Z Stack Carl Zeiss AG 410136-0030-110
ZEN Module Tiles/ Positions Carl Zeiss AG 410136-1025-110
ZEN Module Time Lapse Carl Zeiss AG 410136-1031-110
ZEN Module Experiment Designer Carl Zeiss AG 410136-1022-110
ZEN Desk 2012 Hardware License Key Carl Zeiss AG 410135-1004-120 not available anymore
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Dev. Dyn. 220 (3), 284-289 (2001).
  2. Rozbicki, E., et al. Myosin-II-mediated cell shape changes and cell intercalation contribute to primitive streak formation. Nat. Cell Biol. 17 (4), 397-408 (2015).
  3. Smith, J. L., Schoenwolf, G. C. Neurulation: Coming to closure. Trends Neurosci. 20 (97), 510-517 (1997).
  4. Schoenwolf, G. C., Sheard, P. Shaping and bending of the avian neural plate as analysed with a fluorescent-histochemical marker. Development. 105 (1), 17-25 (1989).
  5. Colas, J. F., Schoenwolf, G. C. Towards a cellular and molecular understanding of neurulation. Dev. Dyn. 221 (2), 117-145 (2001).
  6. Pourquié, O. The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies. Mech. Dev. 121 (9), 1069-1079 (2004).
  7. Maenner, J. Cardiac looping in the chick embryo: A morphological review with special reference to terminological and biomechanical aspects of the looping process. Anat. Rec. 259 (3), 248-262 (2000).
  8. Wittig, J. G., Münsterberg, A. The Early Stages of Heart Development Insights from Chicken Embryos. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 3 (2), (2016).
  9. Layer, P. G., Alber, R. Patterning of chick brain vesicles as revealed by peanut agglutinin and cholinesterases. Development. 109 (3), 613-624 (1990).
  10. Nakamura, H., Nakano, K. E., Igawa, H. H., Takagi, S., Fujisawa, H. Plasticity and rigidity of differentiation of brain vesicles studied in quail-chick chimeras. Cell Differ. 19 (3), 187-193 (1986).
  11. Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. Fate map of the chick embryo neural tube. Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).
  12. Andermatt, I., Stoeckli, E. T. RNAi-based gene silencing in chicken brain development. Methods Mol. Biol. 1082, 253-266 (2014).
  13. Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).
  14. Endo, Y. Chick embryo culture and electroporation. Curr. Protoc. Cell Biol. , Unit 19.15 (2012).
  15. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
  16. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In Ovo Live Imaging of Avian Embryos. Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (6), (2010).
  17. Borwompinyo, S., Brake, J., Mozdziak, P. E., Petitte, J. N. Culture of chicken embryos in surrogate eggshells. Poult Sci. 84 (9), 1477-1482 (2005).
  18. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. J. Vis. Exp. (44), e2154 (2010).
  19. Auerbach, R., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41 (2), 391-394 (1974).
  20. New, D. A. T. A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morphol. 3 (4), 320-331 (1955).
  21. Stern, C. D., Bachvarova, R. Early chick embryos in vitro. Int. J. Dev. Biol. 41 (2), 379-387 (1997).
  22. Nagai, H., Lin, M. C., Sheng, G. A modified cornish pasty method for ex ovo culture of the chick embryo. Genesis. 49 (1), 46-52 (2011).
  23. Connolly, D., McNaugbton, L. A., Krumlauf, R., Cooke, J. Improved in vitro development of the chick embryo using roller-tube culture. Trends Genet. 11 (7), 259-260 (1995).
  24. Rupp, P. A., Rongish, B. J., Czirok, A., Little, C. D. Culturing of avian embryos for time-lapse imaging. Biotechniques. 34 (2), 274-278 (2003).
  25. Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS One. 4 (10), e7429 (2009).
  26. Nagai, H., Sezaki, M., Nakamura, H., Sheng, G. Extending the limits of avian embryo culture with the modified Cornish pasty and whole-embryo transplantation methods. Methods. 66 (3), 441-446 (2014).
  27. Pannett, C., Compton, A. The Cultivation of Tissues in Saline Embryonic Juice. Lancet. 203 (5243), 381-384 (1924).
  28. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3 (3), 419-426 (2008).
  29. . GmbH ZEN 2 – (blue edition) – Software Guide Available from: https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf (2014)
  30. Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. Culture of Avian Embryos. Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).

Tags

Chick EmbryosEx Ovo CultureTime-lapse ImagingNeurulationGastrulationSomitogenesisPannett-Compton SalineAlbumenFilter Paper CarrierVitelline MembraneYolk

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (118), e54636, doi:10.3791/54636 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image