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Developmental Biology

Um Sanduíche papel de filtro submerso por longo prazo<em> Ex Ovo</em> Imagem Time-lapse de galinha precoce embriões

Published: December 28, 2016
doi:
10.3791/54636
, ,
1Department of Orthopaedic Surgery, VU University Medical Center Amsterdam,MOVE Research Institute Amsterdam, 2Department of Anatomy, Embryology & Physiology,Academic Medical Center Amsterdam

Summary

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Abstract

Devido à sua disponibilidade, baixo custo, geometria plana, e transparência, o ex ovo embrião de galinha tornou-se um modelo animal vertebrado importante para o estudo de eventos morfogenéticos, como gastrulação 2, neurulação 3-5, somitogenesis 6, dobra do cardíaco 7, 8, e do cérebro formação 9-13, durante a embriogênese precoce. Chave para entender processos morfogenéticos é segui-los de forma dinâmica por imagem time-lapse. A aquisição de filmes de lapso de tempo de pinto embriogênese ex ovo tem sido limitada, quer para janelas de tempo curtos ou para a necessidade de uma incubadora para controlar a temperatura e umidade em torno do embrião 14. Aqui, apresentamos uma nova técnica para pinto cultura embriões ex ovo de alta resolução de imagem de lapso de tempo usando microscopia de luz transmitida. A sanduíche de papel de filtro submerso é uma variante do transportador Techn papel de filtro bem estabelecidaique (CE-cultura) 1 e permite a cultura de embriões de galinha, sem a necessidade de uma câmara climática. O embrião está ensanduichado entre dois transportadores de papel de filtro idênticas e é mantido totalmente submerso em um meio simples, com temperatura controlada, coberto por uma camada de óleo mineral leve. A partir do estágio primitivo raia (Hamburger-Hamilton estágio 5, HH5) 15 até pelo menos a fase de 28-somite (HH16) 15, os embriões podem ser cultivadas tanto com sua ventral ou dorsal para cima. Isto permite a aquisição de filmes lapso de tempo que cobrem cerca de 30 horas de desenvolvimento embrionário. quadros e filmes representativos de lapso de tempo são mostrados. Os embriões são comparados morfologicamente a um embrião cultivadas na CE-cultura padrão.

O sanduíche de papel de filtro submerso fornece um ambiente estável para estudar dorsal cedo e processos morfogenéticos ventral. Ele também permite que para imagens de fluorescência ao vivo e micromanipulations, como microcirurgia, imp talãolantation, microinjecção, o silenciamento de genes, e electroporação, e tem um grande potencial para ser combinado com objectivos de imersão para imagiologia à base de laser (incluindo microscopia de luz-folha).

Introduction

Embriogênese tem fascinado o homem desde o início da história. Como a estrutura e morfologia de um embrião se desenvolver de forma temporal e espacial tão bem definido? O embrião de galinha tornou-se um dos modelos animais vertebrados clássicos para embriogênese por várias razões: É facilmente disponível, barata, transparente em seus estágios iniciais, e acessível para manipulações experimentais, como ele se desenvolve fora da mãe. Além disso, tem uma geometria quase plano durante eventos morfogenéticos início, como coração e formação do cérebro, gastrulação, neurulação e somitogenesis 15.

processos morfogenéticos pode ser entendido melhor se eles são estudados de forma dinâmica, como através da aquisição de imagens de lapso de tempo. O embrião de galinha pode ser visualizado no ovo 16, mas com fraca acessibilidade para manipulações experimentais e visibilidade limitada para imagens de microscopia de luz de transmissão. Portanto, cortaral técnicas têm sido propostas para cultura de embriões de pintainho ex ovo, quer em sistemas de cultura de gema de inteiros 13,17 – 19 ou como culturas de explantes de 1,20 – 23. Em sistemas de cultura de gema de inteiros, o embrião permanece em cima da gema intacta, e todo o conteúdo do ovo é transferida para um outro recipiente de incubação. Este recipiente pode ser um shell substituto de ovo 17, uma placa de Petri 19, ou uma rede feita de plástico filme plástico 13,18. Embriões em culturas de gema inteiras podem idealmente ser cultivadas até à eclosão e são acessíveis a micromanipulations. Estas técnicas são especialmente úteis para o estudo do desenvolvimento de embriões após o início da circulação sanguínea (o que aumenta o contraste), enquanto que os embriões mais jovens permanecem difíceis de visualizar. Estes embriões podem ser visualizados melhor se eles são excisados da gema e cultivadas como explantes in vitro. Os explantes são facilmente acessíveis para experimentaçãoal manipulações e necessitam de menos espaço para a cultura. Por muitos anos, uma técnica pioneira por Denis Nova em 1955 e suas variações foram os padrões de ouro de métodos de cultura de explantes de embriões de galinha, tornando assim o embrião acessível para microscopia de lapso de tempo e as intervenções de microcirurgia 20,21. Apesar de seu grande sucesso, a técnica de Novo é relativamente exigente e demorado. O blastoderme frequentemente separa quando a membrana vitelina, transportando o blastoderme, é esticada em torno de um anel de vidro para atingir a tensão correcta 1. Além disso, o embrião só podem ser cultivadas, com o lado ventral para cima. A cultura CE (galinha precoce), uma técnica mais recente desenvolvido por Chapman e Collignon 1, evita o estiramento da membrana vitelina, utilizando um transportador de papel de filtro com uma abertura central. O papel de filtro atribui à membrana vitelina, mantendo assim a sua tensão natural, e envolve o embrião como uma moldura 1.Os embriões são então cultivadas em um fundo agar-albumina, geralmente com o seu lado ventral para cima. Cultura dorsal lateral-se parece só é possível para os embriões em HH8 15 e mais velhos. Muitos grupos adaptaram o transportador de papel de filtro para as suas necessidades, tais como através da substituição de parte inferior de agar-albumina com um suporte feito a partir de fibras de sutura cirúrgica 24 ou uma membrana de colagénio revestida 25. Muitas vezes, os embriões cultivados com a técnica de Novo ou com a cultura CE estão expostos, com o seu dorsal ou superfície ventral para o ar para facilitar a difusão de oxigênio 1,20. Estas culturas de explantes têm de ser mantidas numa atmosfera humidificada a fim de evitar a evaporação do meio e para evitar que o embrião de secar. Isto é alcançado através da incubação do prato de cultura com o explante em uma maior prato de Petri contendo papel de tecido humedecido 1. A aquisição de imagens de lapso de tempo de estes embriões requer o uso de uma incubadora de temperatura controlada em torno de todo o microscópio ou uma têmperaAture controlado recipiente com tampa aquecida para evitar a condensação no caminho da luz 14. No entanto, embriões de galinha podem também desenvolver ex ovo completamente submerso em meio de cultura como culturas de papel de filtro 25, ensanduichada entre uma camada de óleo mineral pesado e albumina em adaptações da técnica de Nova 2,21, ou como explantes blastoderme dobradas no "pastoso Cultura Cornish "23,26, sem contato direto com o ar.

O sanduíche de papel de filtro submerso é uma nova variante da técnica de filtro de portador do papel. Ao combinar o conhecimento anterior sobre a cultura de embriões de galinha ex ovo, faz a incubadora de temperatura controlada e a tampa aquecida dispensável. O embrião é colocado entre duas operadoras de papel de filtro idênticos (laser-cut) 24 e cultivados totalmente submerso em um meio simples de cultura (Pannett-Compton solução salina 27,28 e albúmen finas na proporção de 3: 2) em uma temperatura controlada contêmer. Uma camada de óleo mineral leve que flutua no topo do meio evita a evaporação 2,21 e minimiza a perda de calor para o ambiente. O fundo do recipiente tem uma janela de vidro, e toda a configuração é executado em um tempo de trabalho de zoom distância microscópio vertical. Esta configuração permite a aquisição de alta resolução de campo claro e campo escuro filmes de lapso de tempo de cerca de 30 horas de desenvolvimento embrionário, que vão desde a fase de linha primitiva início ao estágio de 28 somite (equivalente a Hamburger Hamilton etapas 5 a 16, HH5-16 ) 15. Os embriões podem ser cultivadas igualmente bem com a sua ventral ou dorsal para cima. Portanto, os embriões são acessíveis à observação e manipulação de ventral (por exemplo, cardíaca precoce 7,8 e somitogenesis 6) e dorsal (por exemplo, tarde gastrulação 2, fechamento do tubo neural 3-5, e do cérebro no início 9-13) desenvolvimento. O filtro submerso papel sanduíche pferece um ambiente simples e estável para microcirurgia, implantação talão, microinjecção, silenciamento de genes, e os estudos de eletroporação. O seu potencial de imagem pode ser empurrado para muito mais longe, utilizando uma imagem baseada em laser (incluindo microscopia de luz folhas) e os objetivos de imersão.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as experiências Holanda sobre Animals Act. NOTA: O filtro método do papel sanduíche submersa é modificado a partir de 1. 1. Filtro Submerso Preparação Sandwich Papel Pannett-Compton (PC) -saline 27,28 Preparar soluções de reserva A (1 L de ultrapura H2O, 121 g de NaCl, 15,5 g de KCl, 10,42 g de CaCl2-H2O, e 12,7 g de MgCl 2 .6H 2 O) e B (1 L de ultrapura H2O, 2,365 g de na 2 HPO 4 2H 2 O ·, e 0,188 g de NaH 2 PO 4 2H 2 O ·) em frascos limpos 1-L. Armazená-los a 4 ° C. Prepare 1 litro de solução salina PC-misturando 900 mL de H2O ultra pura com 40 ml de solução de estoque A e 60 ml da solução de B (nesta ordem para evitar a precipitação). Prepara-PC salina FR recentementeom soluções de A e B a cada semana. NOTA: As soluções de reserva pode ser armazenado a 4 ° C durante vários meses. Autoclavagem e / ou a adição de antibióticos ou antimicóticos não são necessárias. A incubação de ovos de galinha fertilizados Em uma incubadora umidificada, colocar os ovos em seu lado e incubar-los a 37,5 ° C até que atinjam a idade desejada. Nota: Armazenar ovos não superior a duas semanas (de preferência a 12 – 15 ° C) antes da experiência, como a taxa de eclosão irá diminuir significativamente Transportadores de papel de filtro (adaptado a partir de 1) Se possível, use uma máquina de corte a laser para cortar portadores de papel de filtro em forma de ampulheta do papel filtração de espessura (28 mm x 22 mm). Taper a largura no meio de 22 mm a 10,4 mm. Cortar uma abertura elíptica central (10,6 milímetros x 5,5 mm), com o eixo maior da elipse orientada paralelamente ao lado maior do transportador de papel de filtro (Figura 1-H). Opcionalmente, preparar uma matriz de cartão com as dimensões correctas e transferir o seu contorno e que da abertura central para o papel de filtragem de espessura usando um lápis. Recorte o portador do papel de filtro, utilizando uma tesoura fina. Corte duas operadoras de papel de filtro idênticos para cada embrião a ser explantado. Prepare portadores de papel de filtro extras como backup no caso de um embrião se perde durante o explante. A temperatura controlada banho de óleo (no dia da experiência) Colocar a proveta com controlo de temperatura no centro do XY-platina motorizada do microscópio de zoom vertical e ligar o copo para o seu controlador de temperatura. Coloque quatro anéis grandes de aço inoxidável (diâmetro exterior 30 mm, 4 mm de altura, 1,5 milímetros de espessura de parede) em uma placa de Petri de 6 centímetros de agir como pesos e colocar o prato no meio do recipiente de temperatura controlada. NOTA: Esta placa de Petri serve apenas como um espaço reservado para ajustar o leve de óleoeu. Encher o balão com controlo de temperatura com 130 ml de óleo mineral leve. Ajustar o nível de óleo, se necessário, de modo a que ele termina cerca de 3 mm abaixo da borda superior da placa de Petri de 6 centímetros. Remova a placa de Petri de 6 cm a proveta com temperatura controlada e ajustar a temperatura a 40 ° C. 2. Filtro Submerso Sandwich Produção de Papel O meio de cultura (no dia da experiência) Pour 30 ml de PC-solução salina (tal como preparado nos passos 1.1.1 a 1.1.2) para um tubo de centrífuga de 50 ml. Preparar um tubo de centrífuga de 50 ml cheio com 30 ml de solução salina-PC para cada dois embriões a ser explantado. Cuidadosamente quebrar um ovo não incubados em um 10 centímetros placa de Petri. Colher albúmen finas movendo uma pipeta de transferência de plástico ao longo das paredes da placa de Petri e chupando no albúmen finas. Recolha de 30 ml de albumina de finos num tubo de centrífuga de 50 ml para cada dois embriões a ser explantado. Certifique-se de obter apenas o thin albúmen. NOTA: Normalmente 3 – 4 ovos permitir a colheita de cerca de 30 ml de albumina finas. Introduzir 20 ml de albumina de finos em todos os PC-salina preenchido 50 ml tubo de centrifugação (como foi preparado no passo 2.1.1). Misture a solução salina PC-albumina com os finos, invertendo suavemente os tubos várias vezes. Deixe repousar por alguns minutos e verifique se a mistura, chamada meio de cultura a partir daqui em diante, é claro. Se o meio de cultura não é claro, preparar, de fresco PC-salina a partir da solução estoque e colher albúmen finas frescas. Coloque dois anéis pequenos de aço inoxidável (diâmetro externo 20 mm, 4 mm de altura, espessura da parede 1,5 mm, 6,5 gap mm no anel) tão distantes quanto possível em um 6 centímetros de plástico placa de Petri fresco e preenchê-lo com 22 ml de cultura forma (tal como preparado nos passos 1.4.1 a 1.4.4) usando uma pipeta de plástico de 25 ml (Figura 1-H). Certifique-se de que os detritos acumulados na parte superior do meio se mantém no tubo de centrifugação. Remover todos os detritos oR bolhas a partir do meio utilizando uma pipeta de transferência de plástico. Encha com 10 cm numa caixa de Petri com 75 ml de solução salina-PC (para ser utilizado no passo 2.15). Remover um ovo a partir do incubador e deixá-lo assentar no banco de lado durante 1 minuto para permitir que o embrião vir para o topo da gema. Cuidadosamente quebrar o ovo em uma placa de Petri (Figura 1-A). Embeber a ponta de um pedaço de papel de tecido fino na clara de espessura e o centro da blastoderme, puxando, se necessário. Remover a maior parte do endosperma finas e grossas da placa de Petri com uma pipeta de transferência de plástico (com a ponta cortada para facilitar a aceitação do endosperma de espessura). Criar uma janela no albúmen de espessura em torno do embrião suavemente enxugando a clara grossas com um pedaço de papel de seda, afastando-se do centro (Figura 1-B). Impedir que o papel de tecido de se fixar a membrana vitelina. Com uma pinça, coloque cuidadosamente uma transportadora papel de filtro na vitelline membrana em torno do embrião, com o eixo maior da abertura elíptica paralelo ao eixo ântero-posterior do embrião (Figura 1-C). Beliscar uma ponta da tesoura de unhas através da membrana vitelina perto do portador do papel de filtro e rapidamente cortar em torno de todo o suporte de papel de filtro (Figura 1-D). Usando pinças, levantar o portador do papel de filtro para longe da gema numa direcção paralela oblíquo ao eixo ântero-posterior do embrião (figura 1-E). Ligue o transportador de papel de filtro em torno de ter o lado ventral do embrião em cima e pode ser mergulhado na solução de soro fisiológico PC. Mergulha-se o suporte de papel de filtro ao longo do eixo ântero-posterior do embrião numa direcção oblíqua. Se livrar de toda a gema ainda ligado a membrana vitelina eo blastoderm por liberando-o suavemente com o PC-salina a partir de uma pipeta de transferência de plástico. Manter a totalidade do suporte de papel de filtro submerso numall vezes (Figura 1-F). Remover o transportador de papel de filtro a partir do PC-solução salina ao longo do eixo ântero-posterior do embrião numa direcção oblíqua e livrar-se do excesso de líquido, esfregando a borda do suporte em papel de filtro um papel de seda. Segurar o papel de filtro na horizontal, com o lado ventral do embrião virado para cima e colocar outra transportadora de papel de filtro na parte superior do primeiro, usando um segundo par de pinças. Suas aberturas devem corresponder exatamente, imprensando assim o embrião entre as duas camadas de papel de filtro (Figura 1-G). Imediatamente submergir o transportador sanduíche de papel de filtro para o meio de cultura numa direcção oblíqua ao longo do eixo ântero-posterior do embrião. Colocá-lo na área que atravessa o espaço entre os dois anéis de aço (Figura 1-H). Fixar a sanduíche de papel de filtro, colocando mais dois anéis de aço por cima dos outros dois, certificando-se que a abertura com o embryo permanece completamente descoberta (Figura 1-I). Verifique o nível médio e ter certeza de que o espaçador superior é apenas submersa no meio. Se necessário, adicionar ou remover pequenas quantidades de meio. Cuidadosamente colocar a placa de Petri no centro do banho de óleo com temperatura controlada e estabilizar o prato lateralmente colocando três grandes anéis de aço inoxidável (diâmetro de 30 milímetros exterior, de 4 mm de altura, 1,5 milímetros de espessura de parede) ao lado do prato no óleo . Certifique-se de que os anéis de aço toquem os lados do prato (Figura 1-J). Lentamente pipetar cerca de 6 ml de óleo mineral leve na parte superior do meio com uma pipeta de transferência de plástico, de modo que o meio é coberto com uma camada contínua de óleo mineral (Figura 1-K). Configurar a aquisição de lapso de tempo. NOTA: A imagem latente os embriões como panoramas horizontais de cinco sub-imagens sobrepostas (telhas) permite imagens detalhadas (objetiva 5x), com um overvi geralEW da morfologia 29-30. Intervalos de imagem entre 3 e 10 min permitir o acompanhamento detalhado das alterações morfológicas 31, ea aquisição de pequenas Z-stacks (cinco a sete aviões diferentes, com uma distância de 30 mm) compensa a maior parte do espessamento e de viragem do embrião 30 . Z-aviões com o maior contraste pode ser selecionado antes do processamento adicional 32 de quadros individuais em filmes de lapso de tempo (veja a seção de resultados representativos para obter informações detalhadas sobre a aquisição da imagem). Figura 1: Configuração do Sandwich papel de filtro submerso. (A) Um ovo é rachado em uma placa de Petri. (B) A maioria dos albúmen grossos e finos é removida da placa de Petri com uma pipeta de transferência de plástico (não mostrado). Em seguida, uma janela de espessura no albúmen é criado umrodada do embrião suavemente enxugando a clara grossas com um lenço de papel. Portadora de papel (C) Um filtro é colocado em torno da blastoderme em cima da gema. (D) O transportador de papel de filtro é cortada solta a partir da membrana vitelina circundante e (E) removida da parte superior da gema. (F) A gema restante é cuidadosamente lavados em um banho de PC-salina. (G) O embrião é colada com um segundo suporte de papel de filtro idênticas. (H) O papel sanduíche de filtro está submerso no médio e posicionado sobre anéis de aço inoxidável dois de metal (embrião enfrentando dorsal ou lateral ventral para cima). (I) dois anéis de estabilizar a sanduíche a partir do topo. (J) a placa de Petri contendo o embrião é transferido para o banho de óleo de temperatura controlada. anéis de aço inoxidável estabilizar a placa de Petri lateralmente. (K) O meio de cultura é coberto com uma camada de óleo mineral.(G) esquemática da sanduíche de filtro submerso. (M) As dimensões dos suportes de papel de filtro utilizados para a sanduíche de papel de filtro submerso. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Representative Results

Figura 2: Comparação morfológica entre os embriões em cultura CE 1 e na Cultura Sandwich papel de filtro submerso. quadros de lapso de tempo seleccionados mostram os embriões em intervalos de 3 horas. Os quadros são redimensionadas para dar uma visão geral da morfologia do embrião completo. Os embriões foram idade-pareado para a fase 7 somite (HH9) 15. 0 hr indica o início de cada experiência. Anterior, é sempre para a esquerda. As imagens foram adquiridas com uma iluminação de campo escuro. (A) de embriões em cultura CE 1, culta lado ventral em cima de ágar-albumina inferiores a 1,33. As imagens de alta qualidade pode ser adquirida, como o embrião está confinado na direcção z. (B e C) Dois embriões cultivados no sanduíche papel de filtro submerso: (B) lado ventral para cima e (C) dorsal para cima.Embriões no sanduíche de papel de filtro desenvolver sem diferenças qualitativas para, pelo menos, 27 horas. Eles desenvolvem a circulação sanguínea funcional e flexão craniano e cervical e girar com sucesso. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. aquisição de lapso de tempo depende do sistema de microscópio disponível. Neste estudo, uma distância de trabalho longa, foi usada na posição vertical zoom microscópio. O fator de zoom foi ajustado para 5X. Em combinação com a ampliação de 16X da ocular, isto resultou em 80X ampliação total, com uma resolução teórica de 1,3 pM / pixel (tal como indicado no software microscópio) 30. Para aumentar o campo de visão, os embriões foram fotografadas como panoramas horizontais de cinco sub-imagens (telhas). Portanto, uma região da telha, consistindo de cinco telhas sobrepostas, foi definido 29. Esta região telhafoi posicionado de modo a cobrir totalmente a abertura elíptica da transportadora de papel de filtro na sua extensão horizontal (Figura 2B – 0 h). Cada azulejo tinha um tamanho de 2048 x 2048 pixels, que cobre um campo de visão-de, aproximadamente, 2,7 milímetros, e telhas foram adquiridas com uma sobreposição de 10%, resultando no total campo de visão de cerca de 12 milímetros x 2,7 mm para o panorama. O XY-platina motorizada movido em relação ao objectivo, com uma velocidade de aproximadamente 1,75 mm / s, entre a aquisição das peças separadas 29. A imagem ao vivo foi focada na mesoderme presomitic anterior e os sómitos mais recentemente formadas (o foco do nosso grupo de pesquisa). Para compensar a espessamento e curling dos embriões em direção z, pequenas z-stacks (cinco a sete planos diferentes, com uma distância de 30 mm) foram adquiridas em cada ponto 30 do tempo. Estas foram seleccionadas em torno do plano focal da ponta anterior da mesoderme presomitic. A duração do ACQ time-lapseuisition foi definido para 50 horas, e os intervalos de imagens de 3, 4, ou 10 min foram escolhidos 31. A qualidade da aquisição de lapso de tempo poderia ser melhorado, reorientando a cada 5-10 horas e redefinindo o z-stack em torno do novo plano focal ideal. No final do experimento, o conjunto de séries temporais foi editada manualmente, e subconjuntos de imagens contendo o plano z com o melhor foco foram criados e salvos em uma pasta separada 32. Estes subconjuntos de imagens eram em tempo costurado para criar uma série temporal de imagens com o foco ideal. As telhas de cada imagem desta série temporal completa foram costurados e fundidos sem correção de sombreamento 30, e quadros de lapso de tempo foram exportadas como JPEG-imagens de tamanho e 95% a 100% de compressão 32. Os quadros de lapso de tempo foram importados como uma sequência de imagens em software de edição de vídeo profissional. Os detalhados 100% zooms foram estabilizados e o contraste geral foi ajustado para o nosso gosto. O prazo-lapsos finais foram codificard com o codec H.264 e exportados em MPEG-4 recipientes. Os filmes são exibidos em uma taxa de quadros de 15 frames / seg (fps) e uma resolução de 1.920 x 1.080 pixels. A Figura 2 mostra uma comparação entre um embrião em cultura CE 1 (Figura 2A) e dois embriões em cultura a sanduíche de papel de filtro submerso, a ser cultivada uma lado ventral para cima (Figura 2b) e o lado dorsal uma outra para cima (Figura 2C). Todos os embriões foram para a sete fase somito (HH9) 15 e fotografada com uma resolução temporal de 4 minutos (Figura 2A e B) ou 10 minutos (Figura 2C) pareados por idade. quadros selecionados de intervalos de 3 horas são retratados. A cultura CE (Figura 2A) permitiu imagiologia muito estável devido ao embrião que descansa sobre uma estável ágar-albumina inferiores a 1,33. Todo o embrião manteve-se em um plano focal durante todo tele toda time-lapse. Isso poderia ser benéfico para experimentos mais curtos (várias horas) e embriões muito jovens, mas ele vem com um forte confinamento do embrião na z-direção, possivelmente impedindo o seu desenvolvimento tridimensional bem sucedido no longo prazo. No início, o confinamento resultou apenas num ligeiro achatamento lateral da cabeça do embrião em comparação com um embrião em cultura na sanduíche de papel de filtro submerso com o lado ventral para cima (comparar a Figura 2A e 2B, a 0 horas). Mais tarde, o giro da cabeça foi prejudicada (Figura 2A – 21 h) eo batimento cardíaco mais lento. A circulação do sangue quase parou. Veja Suplementar Filme 1 para o lapso de tempo completo do embrião em cultura CE. O painel superior neste filme mostra uma visão geral completa do embrião, enquanto o painel no canto inferior esquerdo visualiza o desenvolvimento coração, em plena resolução. A segmentação da mesoderme presomitic em somites pode ser seen em detalhe no canto inferior direito. Embriões em sanduíche o papel de filtro submerso, por outro lado, foram na sua expansão tridimensional limitada apenas pela tensão natural das membranas que os rodeavam. Eles podem ser cultivadas quer com sua ventral (Figura 2B) ou o lado dorsal para cima (Figura 2C). De qualquer forma, os embriões mostrou somitogenesis contínua, e suas cabeças viradas. Eles desenvolveram flexão craniano e cervical ea circulação sanguínea funcional. Ambos os embriões no sanduíche de papel de filtro foram fotografadas com o foco na mesoderme segmentação, de modo que partes da cabeça moveu-se gradualmente fora de foco como os embriões cresceu, engrossou, e começou a girar, enquanto a parte segmentação da mesoderme permaneceu no foco (comparar com a figura 2B e 2C a 21 horas para 27 horas). Suplementar Movie 2 mostra o filme de lapso de tempo completo do embrião representadona Figura 2B. O intervalo de imagem foi de 4 minutos. O painel superior deste filme mostra uma visão geral completa do embrião. O desenvolvimento do embrião foi fotografada consecutivamente mais de 46 horas, mas depois de aproximadamente 30 horas, o foco na mesoderme segmentação se perdeu devido ao espessamento geral e de viragem do tecido embrionário. O painel inferior esquerdo mostra o desenvolvimento inicial do coração, em plena resolução a partir dos quadros de lapso de tempo adquiridos. Através da fusão de o primórdio cardíaca emparelhado em ambos os lados da linha média, uma estrutura tubular quase linear é formado, que mais tarde começa a bater e inclinando-se para a direita. O painel inferior direito mostra a maioria dos somitos recém-formados e a ponta anterior da mesoderme presomitic em plena resolução e acompanha a formação de novos somitos ao longo do tempo. Suplementar Filme 3 mostra outro embrião em cultura e fotografada do lado ventral para cima no sanduíche papel de filtro submerso. O intervalo de imagem foi de 4 minutos. O filme de cobre the desenvolvimento do embrião a partir da fase HH5-6 a aproximadamente encenar HH14 15, mais ou menos 27 horas de tempo de cultura. A cabeça dobrar formas e progride posteriormente. As formas de coração de seu primórdio bilateral, começa a bater, e se inclina para a direita. Os primeiros três a quatro somites formar simultaneamente. somites adicionais brotam sequencialmente a partir da ponta anterior da mesoderme presomitic. O painel inferior mostra a região da cabeça do embrião em resolução plena, permitindo a observação da dobra cabeça e formação do coração no início de elevado detalhe. Devido à transparência do embrião, o encerramento do tubo neural pode ser observada na região da cabeça futuro. Suplementar Filme 4 exibe formação somite no mesmo embrião em resolução total sobre o tempo de imagem completa no painel inferior. Suplementar Filme 5 mostra o lapso de tempo completo do embrião dorsal cultivados lado para cima (Figura 2C). O intervalo de imagem foi de 10 min. Enquanto o upper painel mostra o desenvolvimento do embrião a partir do sete estágios somite (HH9) para aproximadamente estágio HH16-17, o painel inferior é cortada para exibir as alterações morfológicas no cérebro início nessa fase em resolução máxima. O inchaço local do tubo neural pode ser observado, levando à regionalização da parte frontal do cérebro, mesencéfalo e rombencéfalo, que irá dividir-se em cinco sub-regiões do cérebro embrionário em fases posteriores 13. Além disso, o crescimento das vesículas ópticas podem ser vistos claramente. Após cerca de 30 horas em cultura, o embrião está morrendo. Para mostrar a compatibilidade do papel de filtro submerso sanduíche com manipulações microcirúrgicas, várias microesferas de poliestireno (~ 40 um de diâmetro) foram implantados no ou na vizinhança da mesoderme presomitic de um embrião de galinha em cultura o papel sanduíche de filtro submerso. As microesferas foram lavadas em PBS para remover o tampão de armazenamento e IMPLANTed antes de cobrir o meio de cultura com a camada de óleo mineral leve (comparar para o passo 2.18 do protocolo secção). Uma pipeta de Pasteur de vidro foi utilizado para transferir os grânulos para a superfície do embrião, sob observação através das oculares do microscópio. Cinco buracos foram criados na endoderme raspando suavemente com uma agulha de acupuntura. Uma ferramenta em forma de J feitos por medida, criado por alongamento e flexão uma pipeta de Pasteur de vidro, numa chama, foi utilizado para manipular os grânulos e empurrá-los cuidadosamente nos orifícios até que eles tornaram-se imóveis. Três buracos foram preenchidos com um cordão de cada (Figura 3A – 0 hr e 3B *) e dois furos com duas contas cada (Figura 3A – 0 h). 3A figura mostra, em quadros de lapso de tempo seleccionados, o desenvolvimento do embrião de galinha após a implantação microcirúrgico dos grânulos. Três grânulos foram incorporados com sucesso para dentro do tecido no local desejado, e o seu movimento foi trabalhada através dacurso do experimento em detalhe elevado (Figura 3B). O desenvolvimento do embrião não parecem ser prejudicada pela manipulação ou a presença dos grânulos. Veja Suplementar Filme 6 para o filme de lapso de tempo integral. O intervalo de imagem foi de 4 minutos. Figura 3: Geração de Time-lapse após Microbead Implantação. Prova de princípio experimento mostrando a compatibilidade do papel sanduíche filtro submerso com a implantação microbead. A cabeça do embrião é para a esquerda, mas não foi fotografada durante esta experiência. As imagens foram adquiridas com uma iluminação de campo escuro. (A) seleccionado de lapso de tempo armações mostrando o embrião manipulado em intervalos de 3 horas após a implantação de sete micropérolas (~ 40 um de diâmetro). O embrião alongado e formada continuamente somit adicionales. Três contas parecem ter sido devidamente conectado e se mudou medial com o fluxo de tecido ao longo de 18 h de cultura. Os outros quatro esferas bateu fora de seus buracos entre 6 e 9 horas da cultura e derivou posteriormente. (B) Vista detalhada das três esferas individuais (B1 a B3) implantado no mesoderme presomitic no início do experimento (0 h, B *) e após 12 horas de incubação (B **). O número de somitos recém-formando é indicada (S9 na B * e S18 em B **). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Suplementar Filme 1: EC-cultura Ventral Side Up. Embrião em cultura CE 1, culta lado ventral para cima, desde a fase de sete somite (HH9) 15 em diante em um botto agar-albuminam 1,33. O intervalo de imagem foi de 4 minutos. O tempo relativo é apresentado no canto superior esquerdo. imagens de alta qualidade podem ser adquiridos, como o embrião foi confinado na direção z. Após 21 h, o batimento cardíaco e fluxo de sangue quase foram presos e o embrião tinha começado a se desintegrar. O painel superior mostra uma visão geral redimensionada do embrião, enquanto que os painéis inferiores visualizar desenvolvimento do coração (painel da esquerda) e segmentação da mesoderme presomitic (painel da direita) em resolução completa (100% de zoom). (Clique direito a download). Filme Suplementar 2: Filtro Submerso Sandwich Papel Ventral Side Up. Embrião cultivadas no sanduíche de papel submersa do palco sete somite (HH9) 15 em diante, sid ventrale voltado para cima. O intervalo de imagem foi de 4 minutos. O tempo relativo é exibido no canto superior esquerdo em horas e minutos, reiniciando após 24 horas. O painel superior mostra uma visão geral redimensionada do desenvolvimento do embrião mais de 46 horas, consecutivamente. O painel inferior esquerdo visualiza coração desenvolvimento precoce durante a primeira 10 horas de aquisição de imagem em resolução máxima (100% zoom). O painel inferior direito retrata segmentar mesoderme ao longo de aproximadamente 30 horas de desenvolvimento na resolução total (100% zoom) até que o foco é perdido devido ao espessamento geral e torneamento de tecido embrionário. (Clique direito a download). Filme Suplementar 3: Cabeça Formação Fold. Embrião cultivado lado ventral para cima no sanduíche papel de filtro submerso do que elead-process / estágio cabeça-fold (HH5-6) 15 a aproximadamente o estágio de 22 somite (HH14) 15 ao longo de aproximadamente 27 horas de tempo de cultura. O intervalo de imagem foi de 4 minutos. O tempo relativo é exibido no canto superior esquerdo no he min, reiniciando após 24 horas. O painel superior mostra uma visão geral redimensionada do desenvolvimento do embrião. O painel inferior mostra a região da cabeça do embrião em resolução máxima (100% zoom). A formação da dobra a cabeça eo coração cedo eo fechamento do tubo neural pode ser observado. (Clique direito a download). Filme Suplementar 4: somitogénese. Embrião cultivado lado ventral para cima no sanduíche papel de filtro submerso desde a fase de processo cabeça / head-fold (HH5-6) 15para aproximadamente o estágio de 22 somite (HH14) 15 ao longo de aproximadamente 27 horas de tempo de cultura. O intervalo de imagem foi de 4 minutos. O tempo relativo é exibido no canto superior esquerdo no he min, reiniciando após 24 horas. O painel superior mostra uma visão geral redimensionada do desenvolvimento do embrião. O painel inferior mostra a mesoderme paraxial segmentar em resolução máxima (100% zoom). (Clique direito a download). Filme Suplementar 5: Filtro Submerso Sandwich Papel Dorsal Side Up. Dorsal cultivados lado Embryo-se no sanduíche papel de filtro submerso do sete estágios somite (HH9) 15 a aproximadamente o estágio HH16-17 15. O intervalo de imagem foi de 10 min. O tempo relativo é exibidono canto superior esquerdo em horas e minutos, reiniciando após 24 horas. O painel superior mostra uma visão geral redimensionada do desenvolvimento do embrião. O painel inferior mostra as alterações morfológicas no cérebro cedo na resolução total (100% zoom). O embrião morreram depois de aproximadamente 30 horas em cultura. (Clique direito a download). Filme Suplementar 6: Microbeads implantado. Embrião cultivado lado ventral para cima no sanduíche papel de filtro submerso por cerca de 19 horas, a partir da fase somite nove (HH9-10) 15. O intervalo de imagem foi de 4 minutos. O tempo relativo é exibido no canto superior esquerdo no he min. O painel superior mostra uma visão geral redimensionada da região da cauda com sete micropérolas implantadas no prmesoderme esomitic. O painel inferior mostra a região com micropérolas implantadas em resolução máxima (100% zoom). (Clique direito a download).

Discussion

Como uma nova variante da cultura CE bem estabelecida uma, a sanduíche de papel de filtro submerso facilita a aquisição de campo claro e de campo escuro de lapso de tempo de filmes de longo prazo do início do embrião de pinto ex ovo fazendo uma temperatura e humidade controladas incubadora em torno o microscópio dispensável. Em vez de ser cultivados num semi-sólido de fundo de agar-albumina, os embriões são mantidos totalmente submerso em um meio de cultura simples que consiste em PC-albumina de soro fisiológico e finas. A evaporação e a perda de calor é minimizado por uma camada de óleo mineral que flutua no topo do meio de cultura. Os embriões podem ser cultivadas facilmente, ou dorsal ou ventral lateral-se, sem diferenças visíveis na qualidade. Como mostrado aqui, os embriões no papel sanduíche filtro submerso são acessíveis a intervenções de microcirurgia, como a aplicação de contas embebido com morfogénio. As aplicações futuras incluem fluorescência ao vivo de imagem, microinjeções e eletroporação e silenciamento gênico para manipulate e estudar uma ampla gama de eventos morfogenéticos durante ventral desenvolvimento (por exemplo, coração cedo e somitogenesis) e dorsal (por exemplo, a gastrulação tarde, fechamento do tubo neural, e inicial do cérebro). Um tratamento de droga dependente do tempo é possível, se a placa de Petri contendo a sanduíche de papel de filtro é substituída por uma câmara de perfusão, permitindo a troca de meio de cultura por baixo da camada de óleo mineral. O papel sanduíche filtro submerso vai desenvolver o seu potencial de imagem completa em combinação com imagens baseadas em laser (incluindo microscopia de luz folhas) e os objetivos de imersão.

Algumas dificuldades com a preparação do papel sanduíche filtro submerso serão abordados nos parágrafos seguintes. Embora ele requer apenas uma quantidade moderada de formação a transferência dos embriões a partir da gema para o papel de filtro sanduíche, vários passos ainda pode influenciar de forma significativa a qualidade do embrião em cultura. Antes que o portador do papel de filtro écolocada sobre a gema, a membrana vitelina do embrião em torno deve ser libertado de qualquer albumina de espessura. Só então é que a conexão entre o filtro de papel com a membrana vitelina ser forte o suficiente para resistir a lavagem em PC-salina. O papel de filtro transportando o embrião deve atravessar a interface líquido / ar tão pouco quanto possível para minimizar a tensão sobre as membranas. Uma vez trazido para o PC-solução salina para a lavagem, todo o papel de filtro transportador deve ficar completamente submerso em todos os momentos. O tempo no banho de PC-solução salina deve ser limitada a cerca de 30 – 60 s, como a membrana vitelina irá começar a liberar a partir do papel de filtro. Ainda assim, a limpeza do embrião deve ser executado muito bem, como restos de gema, mais tarde, obscurecem a visão do embrião. Durante a lavagem, nunca aponte o fluxo a partir da pipeta directamente para o embrião, mas sempre radialmente para fora a partir dele. Depois de retirar o embrião a partir do PC-salina, certifique-se de segurar o papel de filtro na horizontal para minimizartensão sobre as membranas embrionárias. Em seguida, estabilizar o embrião com o segundo suporte de papel de filtro. Uma vez que o segundo suporte de papel de filtro é colocada, evitar a criação de qualquer tensão lateral, o que poderia deslocar os transportadores de papel de filtro em relação ao outro e rasgar as membranas embrionárias. Quando a sanduíche de papel de filtro é trazido para o meio de cultura, também deve atravessar a interface ar / líquido apenas uma vez para minimizar a tensão sobre as membranas. O segundo par de anéis de aço inoxidável usados ​​para estabilizar a sanduíche de papel de filtro a partir do topo devem ser colocados muito lentamente e sem qualquer pressão para minimizar a compressão das membranas embrionárias. As pequenas rupturas do opaca do embrião área geralmente curar durante a primeira hora de cultura, mas um embrião danificado pode e deve ser sempre substituída por uma nova amostra antes da camada de óleo é pipetada no topo do meio de cultura.

Para a imagem de um embrião inteiro ou várias amostras para filmes de lapso de tempo de alta resolução, o microfoneroscope deve ser equipado com uma platina motorizada-XY, controlado pelo software de microscópio. É de importância crucial para que o movimento xy-palco com uma velocidade mínima para evitar danos aos embriões e turbulências no meio de cultura e o óleo, o que irá diminuir a qualidade da imagem. Para a aquisição dos filmes de lapso de tempo aqui apresentados, o xy-platina motorizada mudou-se com uma velocidade de aproximadamente 1,75 mm / seg. No futuro, a imagem poderia ser melhorada por primeiro mover o palco para a posição desejada e adquirir a imagem depois de um curto período de repouso para permitir que as vibrações e turbulências desaparecer.

Como uma limitação, usuários em potencial deve estar ciente da distância relativamente longa de trabalho (cerca de 1 cm) necessária para este método de cultura se um microscópio vertical, sem objetivos de imersão é usado. Esta distância de trabalho resulta da camada de meio e de óleo mineral no topo do embrião. No 6 centímetros placa de Petri, a camada de óleo tem um thickness de cerca de 1 – 1,5 mm e o embrião está submersa cerca de 4 mm de profundidade no meio de cultura. Dependendo do diâmetro do objectivo, o bordo superior da placa de Petri de 6 centímetros também pode limitar o acesso ao embrião. Isto pode ser contornado pela utilização de uma antena maior.

A distância de trabalho a partir do topo pode ser ligeiramente reduzido, minimizando as espessuras das camadas de líquido. Além disso, a distância de trabalho a partir de baixo poderia ser minimizado, trazendo o embrião ainda mais para baixo para o fundo da placa de Petri e reduzindo a espessura da janela de vidro da proveta aquecida. Enquanto que o protocolo foi optimizado para trabalhar com um tempo de trabalho de zoom distância microscópio vertical, que pode ser montado num microscópio invertido bem. Os futuros usuários devem ter em mente que submergindo o embrião muito profundamente no meio de cultura pode levar a O 2 -diffusion problemas, embora experimentos preliminares sugerem que a difusão limitada não parece ser um provLEM, contanto que o embrião encontra-se rodeado por um grande suficientemente-reservatório de meio de cultura e o papel de filtro ensanduichada não é pressionado para a parte inferior da placa de Petri.

Outra limitação é o controlo da temperatura. Ao ajustar a temperatura do controlador para a proveta aquecida a 40 ° C, a temperatura no meio equilibra a 37,5 ° C em torno dos embriões quando o meio é coberta com óleo mineral. Isto mostra que alguma energia é perdida entre a parte inferior do recipiente, em que os elementos de aquecimento e o sensor de temperatura situam-se, e a localização dos embriões. O controle de temperatura pode ser otimizado pelo reposicionamento do sensor e redistribuindo os elementos de aquecimento.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem o apoio financeiro de uma subvenção ZonMW-VICI 918.11.635 (Holanda). Os autores gostariam de agradecer à loja de ferramentas da Vrije Universiteit Amsterdam para as suas sugestões práticas e para a fabricação dos componentes de instalação e Jarno Voortman de Carl Zeiss Holanda para os conselhos úteis sobre microscopia. Marjolein Blaauboer foi um grande apoio ao comentar criticamente sobre vários rascunhos do manuscrito.

Materials

Milli-Q Reference Water Purification System Millipore Z00QSV0WW 
Duran laboratory bottles, with caps, 1L Sigma-Aldrich/Duran Z305200-10EA 
Name Company Catalog Number Comments
Solution A
NaCl Merck Millipore 1064041000
KCl Merck Millipore 1049361000
CaCl2 H2O Merck Millipore 1023821000
MgCl2.6H2O Merck/Sigma-Aldrich 13152-1KG-D 
Name Company Catalog Number Comments
Solution B
Na2HPO4.2H2O Merck 1065801000
NaH2PO4.2H2O Merck 1063420250
Name Company Catalog Number Comments
Whatman qualitative filter paper, Grade 595 Sigma-Aldrich 10311611
Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130W, wavelength 10.6 µm Micro Lasersystems
Tork Extra Soft Facial Tissues Tork 140280
Latex gloves Sigma-Aldrich Z645613
EMDAMED EMDA 300.131
Transfer pipettes Sigma-Aldrich Z350613
VWR WITG5.480.003
accu-jet pro Pipette Controller BrandTech Scientific 26332
Serological plastic pipettes, 25mL Sigma-Aldrich CLS4251
Plastic document sleeves
Egg incubator – Incubator mod. Cip Cip 40 Fiem
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) Drost BV (Loosdrecht, NL)
10 cm Tissue culture dishes Sigma-Aldrich P5731
Greiner Bio-one 664160
6 cm Petri dishes Sigma-Aldrich P5481
50ml Centrifuge tubes , Greiner centrifuge tubes  or Cellstar tubes Sigma-Aldrich T2318
greiner bio-one 227261
Name Company Catalog Number Comments
Stainless steel rings, custom-made
Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness
Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring
Nail scissors
Forceps, Dumont #5, Inox Fine Science Tools , F.S.T. 11251-20
Fine, really sharp scissors for cutting filter paper VWR 21-102
M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil Sigma-Aldrich CAS Number 8042-47-5
Name Company Catalog Number Comments
Agar bottoms for EC culture
Agarose Sigma-Aldrich A9539 SIGMA
NaCl Sigma-Aldrich S7653 SIGMA-ALDRICH
Name Company Catalog Number Comments
Microbead implantation
Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) Polysciences, Inc. 16905-1
Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30mm SEIRIN  type J, No.02, 0.12x30mm
PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023 
Name Company Catalog Number Comments
Temperature controlled beaker
RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M Omega RTD-850M
Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M Omega HSRTD-3-100-A-1M
Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 Omega EXTT-3CU-26S-50
3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M Omega MTP-U-M
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P Omega KHLV-103/(10)-P
Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC Omega CNi16D24-C4EIT-DC
Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)
Name Company Catalog Number Comments
Microscope setup
Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN Carl Zeiss AG 495010-0009-000
Objective PlanNeoFluar Z 1.0x/0.25 FWD 56mm Carl Zeiss AG 435281-9100-000
Manual Rotary Control MARC Carl Zeiss AG 435604-0000-000
Transillumination top 450 mot Carl Zeiss AG 435500-9000-000
Motorized measuring stage S 150×100 mot; CAN (D) Carl Zeiss AG 435465-9020-000
Insert plate S, glass 237x157x3mm (D) Carl Zeiss AG 435465-9053-000
Controller EMS 3 Carl Zeiss AG 435610-9010-000
System Control Panel SYCOP 3 Carl Zeiss AG 435611-9010-000
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera Hamamatsu C11440-22CU
Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual Carl Zeiss AG 490004-0025-000
Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US Carl Zeiss AG 410373-0200-000
LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" Carl Zeiss AG 410350-2403-000 not available anymore
ZEN pro 2012 Hardware License key Carl Zeiss AG 410135-1002-120 not available anymore
ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key Carl Zeiss AG 410136-1045-110
ZEN module Z Stack Carl Zeiss AG 410136-0030-110
ZEN Module Tiles/ Positions Carl Zeiss AG 410136-1025-110
ZEN Module Time Lapse Carl Zeiss AG 410136-1031-110
ZEN Module Experiment Designer Carl Zeiss AG 410136-1022-110
ZEN Desk 2012 Hardware License Key Carl Zeiss AG 410135-1004-120 not available anymore
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References

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Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (118), e54636, doi:10.3791/54636 (2016).
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