長期用水中フィルターペーパーサンドイッチ<em>例OVO</emニワトリ初期胚の>タイムラプスイメージング

図2：EC 文化 1 中 と水中フィルターペーパーサンドイッチ培養における 胚間の形態学的比較 。選択したタイムラプスフレームは、3時間間隔で胚を示しています。フレームは、完全な胚の形態の概要を与えるためにサイズ変更されます。胚は7体節期（HH9）15に年齢をマッチさせました。 0時間は、各実験の開始を示します。前部は、左に常にあります。画像は暗視野照明を用いて取得しました。 1,33ボトム寒天卵白上のEC文化1、培養腹側アップ中（A）胚。胚は、z方向に閉じ込められるように、高品質の画像を取得することができます。 （B及びC）浸漬濾紙サンドイッチで培養つ胚（B）までの腹側及び（C）背側まで。ろ紙サンドイッチ内の胚は、少なくとも27時間のための質的な差なしで開発しています。彼らは、機能的な血液循環と頭蓋と子宮頸たわみを開発し、正常に電源を入れます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 タイムラプス取得は、利用可能な顕微鏡システムに依存します。この研究では、長作動距離において、直立ズーム顕微鏡を使用しました。ズーム倍率が5倍に設定しました。接眼レンズの16X倍率との組み合わせで、これは1.3ミクロン/ピクセルの理論分解能（顕微鏡ソフトウェアに記載されているように）30と、80X総合倍率が得られました。視野を増大させるために、胚を5つのサブ画像（タイル）の水平方向のパノラマのように画像化しました。したがって、5重なり合うタイルから成るタイル領域は、29を定義しました。このタイル領域完全に水平延長（ – 0時間図2B）に濾紙担体の楕円形の開口部を覆うように配置しました。各タイルは、約2.7ミリの視野をカバーする2048のx 2048ピクセルの大きさを有し、タイルは、その結果、10％のオーバーラップを用いて取得した視野約12ミリメートル×2.7ミリメートルの合計パノラマ。電動XYステージは、別々のタイル29の取得の間に約1.75ミリメートル/秒の速度で目的に対して相対移動しました。ライブ画像は、前方前体節中胚葉、最も最近形成された体節（当社グループの研究の焦点）に焦点を当てました。 z方向の胚の肥厚やカールを補償するために、小規模のzスタック（30μmの距離で5〜7個の異なる平面）が毎回点30で取得しました。これらは、前体節中胚葉の前方先端の焦点面の周りに選択しました。タイムラプスACQの期間uisitionは50時間とし、3,4、または10分の撮影間隔31を選択しました。 10時間、新しい最適な焦点面の周りにzスタックを再定義する – タイムラプス買収の品質は、すべての5リフォーカスすることによって改善することができました。実験の最後に、全体の時系列は、手動で編集し、ベストフォーカスとz平面を含む画像のサブセットが作成され、別のフォルダ32に保存されました。画像のこれらのサブセットは、時間のステッチ最適焦点と画像の完全な時系列を作成することでした。この完全な時系列の各画像のタイルは、ステッチやシェーディング補正30せずに一緒に融合し、タイムラプスフレームは100％のサイズと95％圧縮32のJPEG-画像としてエクスポートされたされました。タイムラプスフレームは、プロのビデオ編集ソフトウェアに画像シーケンスとしてインポートされました。詳細な100％のズームを安定化し、全体的なコントラストは、私たちの好みに合わせて調整しました。最終的な時間経過は、エンコードしましたH.264コーデックとdおよびMPEG-4コンテナで輸出しました。作品は、15フレーム/秒（FPS）と1920×1,080ピクセルの解像度のフレームレートで表示されます。 図2は、EC文化1（ 図2A）での胚と水没ろ紙サンドイッチ培養2胚、一方が培養腹側まで（ 図2B）および他の1背側を上（ 図2C）との比較を示しています。すべての胚は、年齢をマッチさせた7体節期（HH9）15および4分（ 図2AおよびB）または10分（ 図2C）の時間分解能で画像化しました。 3時間間隔の選択されたフレームが示されています。 EC培養物（ 図2A）が原因で1,33底安定寒天、卵白に載っ胚に非常に安定した撮影を可能にしました。全体の胚はトン全体で1焦点面に残りました彼は全体の時間経過。これは、短い実験（数時間）と非常に初期胚のために有益であり得るが、それはおそらく長期的にはその成功の三次元発展を妨げるz方向の胚の強い閉じ込めが付属しています。初めに、閉じ込めは、その腹側を上に（0時間で、図2Aおよび2Bを比較）で水没ろ紙サンドイッチで培養した胚に比べ胚の頭のわずかな横方向の平坦化をもたらしました。その後、頭の回転が（ 図2A – 21時間）損なわれたと心拍が遅く。血液の循環がほぼ停止しました。 EC培養における胚の完全な時間の経過を補足ムービー1を参照してください。左下のパネルはフル解像度で心臓の開発を可視化しながら、この映画の中の上のパネルは、胚の完全な概要を示しています。体節へ前体節中胚葉のセグメンテーションがseすることができます右下の詳細にアン。 浸漬濾紙サンドイッチにおける胚は、一方のみそれらを囲む膜の自然な張力によってそれらの三次元膨張が制限されました。彼らは腹側（ 図2B）または背側を上（ 図2C）とのいずれかで培養することができました。いずれにしても、胚は連続体節形成を示し、彼らの頭を回しました。彼らは、頭蓋と子宮頸たわみと機能血液の循環を開発しました。頭の部分が徐々に胚を厚く、成長するにつれ、焦点の外に移動し、ターンを開始したように、中胚葉の分割部分にフォーカスがままろ紙サンドイッチの両方の胚は、セグメント化の中胚葉に焦点を当てて画像化しました（21時間〜27時間で図2Bおよび2Cを比較）。 補足ムービー2が描か胚の完全なタイムラプスムービーを示しています図2Bインチ撮像間隔は4分でした。この映画のトップパネルは、胚の完全な概要を示しています。胚の開発が原因で全体の肥厚および胚組織の旋回に連続してオーバー46時間を画像化したが、約30時間後に、セグメント化中胚葉にフォーカスが失われてしまいました。左下のパネルは、取得したタイムラプスフレームからフル解像度で心臓の早期開発を示しています。正中線の両側に対になった心臓原基の融合を介して、ほぼ直線状の管状構造は、後に拍動し、右に曲がり始める、形成されています。右下のパネルには、最近形成された体節とフル解像度での前体節中胚葉の前方先端を示しており、時間をかけて新しい体節の形成を追跡します。 補足ムービー3は、他の胚培養し、水没ろ紙サンドイッチに腹側を上に結像示しています。撮像間隔は4分でした。映画は目を覆いステージHH5-6から約への胚の電子開発は、HH14 15培養時間のオーバーおよそ27時間を上演します。ヘッドは、フォームを折ると後方に進行します。その両側性原基の心臓形は、鼓動を開始し、右に曲がります。最初の3〜4体節を同時に形成します。追加の体節は前体節中胚葉の前方先端から順に出芽しました。下のパネルは、高詳細にヘッド倍と早期の心臓形成の観察を可能にする、フル解像度での胚の頭部領域を示しています。胚の透明性、神経管の閉鎖は、将来の頭部領域で観察することができます。下のパネルでフル撮影時間にわたるフル解像度で同じ胚における補足ムービー4ディスプレイの体節形成。 補足ムービー5は、胚培養背側を上（ 図2C）の完全な時間の経過を示しています。撮像間隔は10分でした。 UPP一方、えーパネルは約ステージHH16-17に7体節期（HH9）からの胚の発育を示し、下のパネルは、フル解像度でその段階で早期の脳内の形態学的変化を表示するようにトリミングされています。神経管の局所の腫れは後の段階13で、胚の脳の5小領域に分割する前脳の地域化、中脳、および後脳、につながる、観察することができます。また、眼胞の成長は明らかに見ることができます。文化の中で約30時間後、胚は死にかけています。 顕微操作、いくつかのポリスチレンビーズ（直径〜40ミクロン）で水没ろ紙サンドイッチの互換性を示すためには、水没ろ紙サンドイッチ培養におけるニワトリ胚の前体節中胚葉の近傍に、または移植しました。マイクロビーズは、記憶バッファとimplanを除去するためにPBSで洗浄しました。テッドは前軽鉱物油の層を有する培地をカバーする（プロトコルセクションの2.18のステップに比較して）。ガラスパスツールピペットは、顕微鏡の接眼レンズを通じて観察下で、胚の表面にビーズを転送するために使用されました。 5つの穴を穏やかに鍼でそれをこすることによって内胚葉で作成されました。火炎中でガラスパスツールピペットを伸ばし、曲げによって作成されたカスタムメイドのJ字型のツールは、ビーズを操作し、彼らは不動になるまで穴に慎重にそれらをプッシュするために使用されました。三つの穴が1ビーズそれぞれを充填した（ 図3A – 0時間および3B *）および2つのビードそれぞれ（ 図3A – 0時間）と二つの穴。 図3Aが示すように 、選択されたタイムラプスフレームで、ビーズの顕微注入後のニワトリ胚の開発。三ビーズが正常所望の位置で組織に組み込まれ、それらの動きを画像化した上で高詳細（ 図3B）での実験の過程。胚の開発は、操作またはビーズの存在によって損なわれていないようでした。フルタイムラプスムービーの補足ムービー6を参照してください。撮像間隔は4分でした。 図3： マイクロビーズ移植後のタイムラプスイメージング。マイクロビーズの注入で水没ろ紙サンドイッチの互換性を示す証明の原理実験。胚の頭が左にあるが、それは、この実験中に画像化されていませんでした。画像は暗視野照明を用いて取得しました。 （A）選択したタイムラプス7マイクロビーズの移植後3時間の間隔で操作胚を示すフレーム（〜40μmの直径）。胚は細長く、継続的に追加somitを形成しますエス。スリービーズは、適切に取り付けられており、文化の18時間にわたる組織の流れと内側に移動されているように見えます。他の4つのビーズは、文化の6と9時間の間、その穴からポップされ、後方に漂流しました。実験開始（0時間、B *）とのインキュベーションの12時間後（B **）で前体節中胚葉に移植（B）3つの単一のビーズの詳細ビュー（B1〜B3の）。ちょうど形成体節の数は、（BのB *におけるS9とS18 **）が表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 補足ムービー1：EC- 文化腹側アップ。 7体節期以降寒天卵白だぼっ上（HH9）15から1、培養腹側までのEC培養中の胚、メートル1,33。撮像間隔は4分でした。相対時間は、左上隅に表示されます。胚は、z方向に閉じ込められたように、高品質の画像を取得することができます。 21時間後、ハートビートと血流がほとんど逮捕され、胚が崩壊し始めていました。下のパネルは、フル解像度（100％ズーム）で前体節中胚葉（右パネル）の心臓発生（左パネル）およびセグメンテーションを視覚化しながら、上のパネルは、胚のサイズ変更された概要を示します。 （右クリックしてダウンロード）。 補足ムービー2： 水中フィルターペーパーサンドイッチ腹側アップ。以降7体節期から水没紙サンドイッチ（HH9）15、腹側sidの培養胚eは上向きに。撮像間隔は4分でした。相対時間は、24時間後に再起動し、時間と分で左上隅に表示されます。上のパネルは連続して、46時間以上の胚の発育のサイズ変更された概要を示します。左下のパネルには、フル解像度（100％ズーム）での画像取得の最初の10時間の間、早期の心臓の開発を可視化します。右下のパネルは、フォーカスが原因で全体の肥厚および胚組織の旋回に失われるまで、フル解像度（100％ズーム）で、開発の約30時間かけて中胚葉をセグメント描いています。 （右クリックしてダウンロード）。 補足ムービー3： ヘッドフォールド形成。彼からの浸水ろ紙サンドイッチにおける胚培養腹側を上に広告・プロセス/ヘッド倍段階（HH5-6）15約22体節期（HH14）に培養時間の15以上のおよそ27時間。撮像間隔は4分でした。相対時間は、24時間後に再起動し、時間と分で左上隅に表示されます。上のパネルは、胚の発育のサイズ変更された概要を示します。下のパネルは、フル解像度（100％ズーム）で胚の頭部領域を示しています。ヘッド倍と早期の心臓や神経管の閉鎖の形成を観察することができます。 （右クリックしてダウンロード）。 補足ムービー4： 体節形成。ヘッド・プロセス/ヘッド倍段階から水没ろ紙サンドイッチ（HH5-6）15における胚培養腹側アップ培養時間の約27時間かけて約22体節期（HH14）15。撮像間隔は4分でした。相対時間は、24時間後に再起動し、時間と分で左上隅に表示されます。上のパネルは、胚の発育のサイズ変更された概要を示します。下のパネルは、フル解像度（100％ズーム）に分割近軸中胚葉を示しています。 （右クリックしてダウンロード）。 補足ムービー5： 水中フィルターペーパーサンドイッチ背サイドアップ。約HH16-17ステージ15に7体節期（HH9）15から水没ろ紙サンドイッチにおける胚培養背側アップ。撮像間隔は10分でした。相対時間が表示されます。時間と分で左上隅に、24時間後に再起動します。上のパネルは、胚の発育のサイズ変更された概要を示します。下のパネルは、フル解像度（100％ズーム）の初期の脳の形態変化を示しています。胚は、培養中の約30時間後に死亡しました。 （右クリックしてダウンロード）。 補足ムービー6： マイクロビーズ移植。 9体節期（HH9-10）15から出発し、約19時間、のための水没ろ紙サンドイッチにおける胚培養腹側アップ。撮像間隔は4分でした。相対時間は、時間と分で左上隅に表示されます。上のパネルは、PRに移植7マイクロビーズとテール領域のサイズ変更された概要を示しますesomitic中胚葉。下のパネルは、フル解像度（100％ズーム）で注入されたマイクロビーズを有する領域を示しています。 （右クリックしてダウンロード）。