JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך<em> אקס אובו</em> זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ'יק עובר

Published: December 28, 2016
doi:
10.3791/54636
, ,
1Department of Orthopaedic Surgery, VU University Medical Center Amsterdam,MOVE Research Institute Amsterdam, 2Department of Anatomy, Embryology & Physiology,Academic Medical Center Amsterdam

Summary

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Abstract

בשל זמינותו, בעלות נמוכה, גיאומטריה שטוחה, ושקיפות, לשעבר אובו עובר אפרוח הפכה מודל בעלי חיים בעלי חוליות גדול לחקר אירועי המוךפו"גנטי שהולכים, כגון gastrulation 2, neurulation 3 – 5, somitogenesis 6, לב כיפוף 7, היווצרות 8, והמוח 9 – 13, במהלך העובר מוקדם. מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך הוא לעקוב אחריהם באופן דינמי על ידי זמן לשגות הדמיה. רכישת זמן לשגות סרטים של אובו לשעבר חומוס העובר הוגבלה או חלונות זמן קצרות או על הצורך באינקובטור לשלוט בטמפרטורה ולחה סביב העובר 14. כאן, אנו מציגים טכניקה חדשה כדי חומוס התרבות עוברת אובו לשעבר הדמיה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות באמצעות מיקרוסקופ אור מועבר. כריך נייר פילטר השקוע הנו נגזר של techn נייר המוביל והמבוסס המסנןique (תרבות EC) 1 ומאפשר של עוברים חומוס ללא צורך בתא האקלים. העובר הוא דחוק בין שתי נושאות בנייר זהה מסנן והוא כל זמן שקוע לחלוטין בתווך פשוט, בקרת טמפרטורה מכוסית בשכבה של שמן מינרלי אור. החל משלב פס פרימיטיבי (המבורגר, המילטון בשלב 5, HH5) 15 עד לפחות בשלב 28-somite (HH16) 15, עוברים יכול להיות מתורבת עם עד משני הצדדים הגחון או הגב שלהם. זה מאפשר רכישת זמן לשגות סרטים ומכסים כ 30 שעות של התפתחות עוברית. מסגרות זמן לשגות סרטים נציג מוצגים. עובר מושווים מורפולוגית לעובר בתרבית EC-התרבות הסטנדרטית.

כריך נייר פילטר השקוע מספק סביבה יציבה ללמוד הגבו מוקדם ותהליכים המוךפו"גנטי שהולכים גחון. זה גם מאפשר דימות פלואורסצנטי חיים micromanipulations, כגון המיקרו-כירורגיה, שד חרוזlantation, microinjection, להשתקת גנים, ואת electroporation, ויש לו פוטנציאל חזק כדי להיות משולב עם מטרות טבילה הדמיה מבוססי לייזר (כולל מיקרוסקופ אור גיליון).

Introduction

העובר בשלב ריתק אדם מאז תחילת ההיסטוריה. איך המבנה והמורפולוגיה של עובר להתפתח בצורה של זמן ומרחב מוגדר היטב כל כך? העובר החומוס הפך לאחד הדגמים בעלי החיים בעלי חוליות הקלסיים עבור עובר מכמה סיבות: זה זמין בקלות, זול, שקוף בשלביה הראשונים, ונגיש מניפולציות ניסיון, כפי שהוא מתפתח מחוץ אמא. יתר על כן, יש לו גיאומטריה שטוחה כמעט במהלך אירועי המוךפו"גנטי שהולכים מוקדם, כגון לב היווצרות המוח, gastrulation, neurulation, ו somitogenesis 15.

ניתן להבין בצורה הטובה ביותר תהליכים המוךפו"גנטי שהולכים אם הם נלמדים באופן דינמי, כגון באמצעות רכישת זמן לשגות תמונות. העובר חומוס ניתן דמיינו ב אובו 16 אבל עם נגישות נמוכה מניפולציות ניסיוני וראות מוגבלת הדמיה מיקרוסקופ אור ההולכה. לכן, לנתקטכניקות אל הוצעו על מנת אובו לשעבר חומוס עוברים תרבות, גם במערכות תרבות חלמון כולה 13,17 – 19 או תרבויות explant 1,20 – 23. במערכות תרבות חלמון כולו, העובר נשאר על גבי החלמון שלם, ואת התוכן כולו של הביצה מועברת למיכל אחר לאינקובטורים. מיכל זה יכול להיות מעטפת ביצית פונדקאית 17, בצלחת פטרי 19, או ערסל עשוי בניילון נצמד 13,18. עוברים בתרבויות חלמון כולו באופן אידיאלי יכול להיות מתורבת עד הבקיעה והם נגישים micromanipulations. שיטות אלה יעילות במיוחד ללימוד פיתוח של עוברים לאחר תחילתו של מחזור הדם (דבר המגדיל את הניגוד), בעוד עוברי הצעיר להישאר קשה לדמיין. עוברי מוקדם אלה יכולים להיות צילמו הכי טוב אם הם נכרת מן החלמון מתורבת כמו explants במבחנה. Explants הם נגישים בקלות עבור הניסוימניפולציות אל ודורשים פחות מקום עבור culturing. במשך שנים רבות, טכניקת החלוץ ידי דניס החדש ב -1955 הווריאציות שלה היו סטנדרטי זהב של שיטות תרבות explant עבור עבר חומוס, ובכך להפוך את העובר נגיש עבור מיקרוסקופיה זמן לשגות והתערבויות microsurgical 20,21. למרות ההצלחה הגדולה שלו, הטכניקה החדשה היא יחסית תובענית זמן רב. Blastoderm לעתים קרובות מנתק כאשר קרום vitelline, נושאת את blastoderm, נמתח סביב טבעת זכוכית כדי להשיג את המתח הנכון 1. יתר על כן, העובר יכול להיות מתורבת רק עם למעלה בצד הגחון שלה. הנציבות האירופיות התרבות (מוקדם צ'יק), טכניקה חדשה יותר פותחה על ידי צ'פמן Collignon 1, עוקפת את המתיחה של קרום vitelline באמצעות הספק נייר פילטר עם צמצם מרכזי. העיתון המסנן מייחס את קרום vitelline, ובכך שמירת המתח הטבעי שלה, והיא מקיפה את העובר כמו מסגרת תמונה 1.הם עוברים בתרבית על התחתונה אגרה-חלבון, בדרך כלל עם למעלה בצד הגחון שלהם. Culturing כלפי מעלה הגבי נראה אפשרי רק עבור העוברים HH8 15 ומעלה. קבוצות רבות יש להתאים את הספק נייר סינון לצרכים שלהם, כגון על ידי החלפת התחתונה אגר-חלבון עם תמיכה מסיבים תפר כירורגי 24 או קולגן מצופה קרום 25. לעתים קרובות, עוברים תרבותי עם הטכניקה החדשה או עם תרבות EC נחשפים, עם הגב שלהם או משטח הגחון לאוויר כדי להקל דיפוזיה חמצן 1,20. יש תרבויות explant אלה כדי להישמר באווירה humidified כדי למנוע אידוי של המדיום וכדי למנוע את העובר מפני התייבשות. זו מושגת על ידי דוגר את המנה עם תרבות explant בצלחת פטרי גדולה המכילה רקמות לחלחו נייר 1. רכישת זמן לשגות תמונות של עוברים אלה דורש גם את השימוש של חממה אקלים מבוקר סביב המיקרוסקופ כולו או מזגature שבשליטת מיכל עם מכסה מחומם כדי למנוע התעבות של נתיב האור 14. עם זאת, עוברים חומוס יכול גם לפתח לשעבר אובו שקוע לחלוטין במדיום תרבות כמו תרבויות נייר פילטר 25, בסנדוויץ 'בין שכבה של שמן מינרלי כבד חלבון ב adaptions של הטכניקה החדשה 2,21, או כמו explants blastoderm מקופל "קורניש בצקי תרבות "23,26, ללא מגע ישיר עם האוויר.

כריך נייר פילטר השקוע הוא גרסה חדשה של הטכניקה המובילה נייר סינון. על ידי שילוב של ידע מוקדם על culturing עובר חומוס אובו לשעבר, זה הופך את חממת האקלים מבוקרת ואת המכסה המחומם אפשר לוותר עליהן. העובר הוא דחוק בין שתי נושאות נייר סינון זהה (בחיתוך ליזר) 24 ותרבותי שקוע לחלוטין בתוך מדיום תרבות פשוטה (Pannett-קומפטון מלוח 27,28 ו חלבון רזה לייחס 3: 2) ב בטמפרטורה המבוקרת מכיליםאה. שכבת שמן מינרלי אור צף על גבי המדיום מונעת 2,21 אידוי וממזער אובדן חום לסביבה. תחתית המכל יש חלון זכוכית, ואת ההתקנה כולה מתבצעת על מיקרוסקופ זום מרחק עבודה ארוכה זקוף. התקנה זו מאפשרת רכישת סרטים זמן לשגות brightfield ו darkfield ברזולוציה גבוהה של כ -30 שעות של ההתפתחות העוברית, החל משלב פס פרימיטיבי מוקדם לשלב 28-somite (שווה ערך ל המבורגר המילטון בשלבים 5 עד 16, HH5-16 15). עוברים יכול להיות מתורבת באותה מידה עם למעלה בצד הגחון או הגב שלהם. לכן, עוברים נגישים תצפית ומניפולציה של הגחון (למשל, לב מוקדם 7,8 ו somitogenesis 6) ו הגבי (למשל, בסוף gastrulation 2, סגירת הצינור העצבי 3 – 5, ובתחילת המוח 9 – 13) פיתוח. את p כריך נייר סינון שקועrovides סביבה פשוטה ויציבה עבור המיקרו-כירורגיה, השתלת חרוז, microinjection, להשתקת גנים, ומחקרים electroporation. פוטנציאל הדמיה שלה יכול להיות דחף הרבה יותר על ידי שימוש הדמיה מבוססי לייזר (כולל מיקרוסקופ אור גליון) ויעדים טבילה.

Protocol

כל הפרוצדורות בוצעו בהתאם ניסויי הולנד על בעלי חי חוק. הערה: שיטת כריך נייר הסינון השקועה היא שונה מ -1. 1. הכנת מסנן שקוע סנדוויץ נייר Pannett-קומפטון (PC) -saline 27,28 להכין פתרונות מניות (1 ליטר של ultrapure H 2 O, 121 גרם של NaCl, 15.5 גרם של KCl, 10.42 גר 'CaCl 2 · H 2 O, ו -12.7 גרם של MgCl 2 · 6H 2 O) ו- B (1 ליטר של ultrapure H 2 O, 2.365 גרם של Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, ו 0.188 גרם של 2 לאא PO 4 · 2H 2 O) בבקבוקים 1-L נקי. ולאחסן אותם ב 4 ° C. הכן 1 ליטר של מלוחים PC ידי ערבוב 900 מ"ל של ultrapure H 2 O עם 40 מ"ל של פתרון המניות ו -60 מ"ל של B פתרון המניות (לפי סדר זה, כדי למנוע משקעים). כן fr PC-מלוח הטריפתרונות המניות אום א 'וב' כל שבוע. הערה: פתרונות מניות יכולים להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. מעוקר ו / או הוספת אנטיביוטיקה או antimycotics אינה נחוצה. דגירה של ביצי תרנגולת מופרות חממה humidified, מטילים את הביצים בצד שלהם דגירה אותם על 37.5 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לגיל הרצוי. הערה: חנות ללא ביצים יותר משבועיים (רצוי 12 – 15 ° C) לפני הניסוי, כמו hatchability יקטן באופן משמעותי ספקי נייר סינון (מותאם מ 1) אם זמין, להשתמש במכונת חיתוך ליזר לחתוך ספקי נייר פילטר בצורת שעון חול מנייר סינון עבה (28 מ"מ x 22 מ"מ). להתחדד רוחב באמצע מ -22 מ"מ עד 10.4 מ"מ. לגזור צמצם אליפטי מרכזי (10.6 מ"מ x 5.5 מ"מ), עם הציר כבר המקבילי חוקי האליפסה לצד הגדול של מוביל נייר סינון (איור 1-M). לחלופין, להכין שבלונה מקרטון עם הממדים הנכונים ולהעביר מתאר שלה וכי של הצמצם המרכזי נייר סינון עבה בעפרון. לגזור מוביל נייר סינון באמצעות מספריים בסדר. חותך שתי נושאות נייר סינון זהות עבור כל עובר להיות explanted. כן ספקי נייר סינון נוספים כגיבוי למקרה עובר הולך לאיבוד במהלך explanting. אמבטית בקרת טמפרטורת שמן (ביום של הניסוי) מניח את כוס בקרת הטמפרטורה במרכז של XY-הבמה הממונע של המיקרוסקופ זום זקוף ולחבר את הכוס אל בקר הטמפרטורה שלה. שים ארבע טבעות נירוסטה גדול (30 מ"מ קוטר חיצוני, 4 מ"מ גובה, 1.5 עובי דופן מ"מ) לתוך צלחת 6 ס"מ פטרי לפעול כמו משקולות במקום צלחת באמצע כוס בקרת טמפרטורה. הערה: צלחת פטרי זה רק משמש כמציין מיקום להתאים את leve שמןl. מלאו את כוס בקרת טמפרטורה עם 130 מ"ל של שמן מינרלי אור. התאם את מפלס השמן במידת הצורך, כך שהוא יסתיים כ -3 מ"מ מתחת לקצה העליון של המנה 6 ס"מ פטרי. מוציאים את המאפה 6 ס"מ פטרי מקנקן בקרת טמפרטורה ולהגדיר את הטמפרטורה ל 40 מעלות צלזיוס. 2. הפקת סנדוויץ נייר סינון שקוע בינוני תרבות (ביום של הניסוי) יוצקים 30 מ"ל של תמיסת מלח PC (כפי שהוכנו בצעדים 1.1.1 1.1.2) לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל. הכן צינור צנטריפוגות אחד 50 מ"ל מלא 30 מ"ל של תמיסת מלח מחשב לכל שני עוברים להיות explanted. בזהירות לפצח ביצה הלא מודגרות לתוך צלחת 10 ס"מ פטרי. קציר חלבון רזה על ידי העברת פיפטה העברת פלסטיק לאורך הקירות של צלחת פטרי ולהכניס פנימה את החלבון דק. אסוף 30 מ"ל חלבון רזה צינור צנטריפוגות 50 מ"ל לכל שני עוברים להיות explanted. הקפד לקבל רק את tין חלבון. הערה: בדרך כלל 3 – 4 ביצים לאפשר את המסיק של כ -30 מ"ל של חלבון רזה. יוצקים 20 מ"ל של חלבון רזה לתוך כל-מלוחים PC מלא 50 מ"ל צינור צנטריפוגות (כפי מוכן בשלב 2.1.1). מערבבים את-מלוחים PC עם חלבון רזה על ידי היפוך בעדינות את הצינורות מספר פעמים. תן לו להתיישב במשך כמה דקות ולבדוק אם התערובת, שנקראה בינוני תרבות מכאן ואילך, ברורה. אם מדיום התרבות אינו ברור, להכין PC-מלוח טרי מפתרון המניות ולמסוק חלבון רזה טרי. מניח שתי טבעות נירוסטה קטנות (20 מ"מ קוטר חיצוני, 4 מ"מ גובה, עובי דופן 1.5 מ"מ, 6.5 פער מ"מ הטבעת) רחוק ככל האפשר בצלחת פטרי 6 סנטימטרי פלסטיק טריה ולמלא אותו עם 22 מיליליטר של תרבות בינוני (כפי שהוכנו בצעדים 1.4.1 כדי 1.4.4) בעזרת פיפטה פלסטיק 25 מ"ל (איור 1-H). ודא כי הפסולת שהצטברו על גבי המדיום נשאר בצינור צנטריפוגות. הסר o פסולתr בועות מהמדיום בעזרת פיפטה העברת פלסטיק. למלא צלחת 10 ס"מ פטרי עם 75 מ"ל של תמיסת מלח PC (לשמש בשלב 2.15). הסר ביצה מן החממה ולתת לו לנוח על הספסל על צידו דקות 1 לתת העובר לבוא העליון של החלמון. בזהירות לסדוק את הביצה לתוך צלחת פטרי (איור 1-A). משרה את הקצה של פיסת נייר טישו משובח החלבון העבה ומרכז את blastoderm ידי משייכת, במידת צורך. הסר ביותר של החלבון הדק בעובי מצלחת פטרי בעזרת פיפטה פלסטיק העברה (עם הקצה לחתוך כדי להקל על הספיגה של החלבון העבה). צור חלון החלבון העבה סביב העובר על ידי מוחה את החלבון העבה בעדינות עם פיסת נייר טישו, מתרחק מהמרכז (איור 1-B). למנוע את נייר האריזה מן נלוות קרום vitelline. בעזרת פינצטה, בזהירות למקם נשאית נייר סינון על Viteקרום lline סביב העובר, עם ציר כבר המקבילי הצמצם אליפטי לציר האחורי-הקדמי של העובר (איור 1-C). לצבוט קצה אחד של מספריים לציפורניים דרך הממברנה vitelline הקרובה למוביל נייר הסינון לחתוך במהירות ברחבי מוביל נייר סינון כולה (איור 1-D). בעזרת פינצטה, הרם את המוביל נייר סינון מן החלמון הקבלה בכיוון אלכסוני לציר הקדמי, האחורי של העובר (איור 1-E). סובבו את הספק נייר סינון סביב להיות בצד הגחון של העובר על גבי להשקיע אותה-מלוחים PC. לטבול מוביל נייר הסינון לאורך הציר הקדמי, אחורי של העובר בכיוון אלכסוני. היפטר כל החלמון עדיין מחוברת הממברנה vitelline ואת blastoderm ידי שטיפתו בעדינות עם מי מלח מחשב מפני פיפטה פלסטיק העברה. שמור את המכלול המוביל נייר סינון שקוע בכלפעמים LL (איור 1-F). סר המוביל נייר סינון מן-המלוח PC לאורך הציר הקדמי, אחורי של העובר בכיוון אלכסוני ו להיפטר הנוזל העודף בטופחו הקצה המוביל נייר הסינון על ממחטת נייר. החזק את נייר הסינון אופקי, עם הצד הגחוני של העובר פונה כלפי מעלה, ומניח אחר המובילים נייר פילטר על גבי הראשון, באמצעות זוג נוסף של פינצטה. הפתחים שלהם צריכים להתאים בדיוק, ובכך רבדה העובר בין שתי השכבות של נייר סינון (איור 1-G). מייד להטביע את הכריך המוביל נייר סינון לתוך מדיום התרבות בכיוון אלכסוני לאורך ציר ה- הקדמי, האחורי של העובר. מניח אותו באזור מחלק את המרחב בין שתי טבעות הפלדה (איור 1-H). תקן את כריך נייר פילטר על ידי הצבת שתי טבעות פלדה יותר על גבי שני אחרים, ולוודא כי הצמצם עם הדוארmbryo השרידים שנתגלו לחלוטין (איור 1-I). בדוק את הרמה הבינונית לוודא כי spacer העליון רק הוא שקוע בתוך המדיום. במידת הצורך, להוסיף או להסיר כמויות קטנות של המדיום. בזהירות במקום צלחת פטרי במרכז באמבטיה שמן בקרת טמפרטורה ולייצב את המנה רוחבית על ידי הצבת שלוש טבעות נירוסטה גדול (30 מ"מ קוטר חיצוני, 4 מ"מ גובה, 1.5 עובי דופן מ"מ) לצד המנה בשמן . ודא כי טבעות פלדה לגעת בדפנות של המנה (איור 1-J). לאט פיפטה כ -6 מ"ל של שמן מינרלי אור על גבי המדיום עם טפטפת העברת פלסטיק, כך המדיום מכוסה שכבה רציפה של שמן מינרלי (איור 1-K). הגדר את רכישת זמן לשגות. הערה: הדמיה העוברים כמו פנורמות אופקיות של חמש תמונות תת חופפים (אריחים) מאפשרת הדמיה מפורטת (אובייקטיבית 5X), עם overvi כלליEW של מורפולוגיה 29-30. במרווחי הדמיה בין 3 ל 10 דק 'לאפשר המעקב המפורט של מורפולוגיים משנה 31, ורכישת Z- ערימות קטנות (חמישה עד שבעה מטוסים שונים, תוך שמירת מרחק של 30 מיקרומטר) מפצים על הרבה של עיבוי המפנה של העובר 30 . ניתן לבחור Z-מטוסים עם הניגוד הגבוה ביותר לפני עיבוד נוסף 32 של מסגרות יחידה לתוך סרטי הזמן לשגות (ראה סעיף נציג תוצאות לקבלת מידע מפורט על רכישת תמונה). איור 1: הגדרת סנדוויץ נייר סינון השקוע. (א) ביצה סדוקה לתוך צלחת פטרי. (ב) רוב החלבון באש ובמים יוסרו צלחת פטרי עם טפטף פלסטיק העברה (לא מוצג). לאחר מכן, חלון החלבון העבה הוא יצרסביב העובר על ידי מוחה את החלבון העבה בעדינות עם נייר טישו. (C) מנשא נייר הסינון ממוקם סביב blastoderm על גבי החלמון. (ד) המוביל נייר המסנן להתנתק מן הקרום vitelline שמסביב (E) הוסרו מהחלק העליון של החלמון. (ו) חלמון הנותרים הוא נשטף בזהירות באמבט PC-מלוח. (ז) עובר הוא דחוק עם מנשא נייר סינון זהה שני. (ע) כריך נייר פילטר טבול בתוך המדיום ואת מיקומו על שתי טבעות נירוסטה מתכת פלדה (הגבי פונה העובר או בצד הגחון למעלה). (אני) שתי טבעות לייצב את הכריך מלמעלה. (י) את צלחת פטרי שמכילה את העובר מועבר אמבט שמנים עם בקרת טמפרטורה. טבעות פלדת אל-חלד לייצב את צלחת פטרי רוחבית. (יא) בינוני התרבות מכוסה בשכבה של שמן מינרלי.(L) סכמטי של הכריך המסנן השקוע. (M) מידות של ספקי נייר פילטר המשמשים את כריך נייר פילטר השקוע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Representative Results

איור 2: השוואת מורפולוגי בין העוברים EC תרבות 1 ובתרבות סנדוויץ מסנן נייר שקוע. מסגרות זמן לשגות נבחרים להראות את העוברים על 3 במרווחים hr. מסגרות תשתנינה לתת סקירה של מורפולוגיה עובר מלאה. העוברים היו גיל בהתאמה לשלב 7-somite (HH9) 15. hr 0 מציין את תחילת כל ניסוי. Anterior היא תמיד שמאלה. תמונות נרכשו באמצעות תאורה darkfield. (א) העובר בתרבות EC 1, בצד גחון בתרבית עד על-חלבון אגר 1,33 תחתון. תמונות באיכות גבוהה ניתן לרכוש, כמו העובר כלוא בתוך-בכיוון z. (B ו- C) שני עובר בתרבית כריך נייר פילטר השקוע: (ב) בצד גחון עד ו- (ג) הגבה פונה כלפי מעלה.עוברים את הכריך נייר פילטר להתפתח ללא הבדלים איכותיים עבור שעה 27 לפחות. הם מפתחים את זרימת דם פונקציונלית כפפו גולגולת צוואר רחם ולהפוך בהצלחה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. רכישת זמן לשגות תלויה במערכת מיקרוסקופ זמינה. במחקר זה, מרחק עבודה ארוך, מיקרוסקופ זום הזקוף היה בשימוש. גורם זום נקבע 5X. בשילוב עם הגדלה 16X של העינית, זה הביא 80x הגדלה מוחלטת, עם רזולוציה תיאורטי של 1.3 מיקרומטר / פיקסל (כאמור התוכנה מיקרוסקופ) 30. כדי להגדיל את השדה של נוף, עובר הם צלמו כמו פנורמות אופקיות של חמש תמונות משנה (אריחים). לכן, אזור אריח, מורכבת מחמישה אריחים חופפים, הוגדר 29. באזור אריח זההוצב כך שיכסה את הצמצם אליפטי מלא של מוביל נייר הסינון בתוסף האופקי שלה (איור 2 ב – 0 hr). היה כל אריח בגודל של 2,048 x 2,048 פיקסלים, המשתרע על שדה של נוף של כ -2.7 מ"מ, ואריחים נרכשו עם חפיפה של 10%, וכתוצאה מכך בתחום של נוף כולל של כ 12 מ"מ x 2.7 מ"מ עבור הפנורמה. XY-הבמה הממונעת עברה ביחס המטרה עם מהירות של כ 1.75 מ"מ / sec בין רכישת האריחים הנפרדים 29. תמונת חיים התמקדה mesoderm presomitic הקדמי ואת somites ביותר הקים לאחרונה (מוקד המחקר של הקבוצה שלנו). כדי לפצות על העיבוי והמסתלסל של העוברים-בכיוון z, Z- ערימות קטנות (חמישה עד שבעה מטוסים שונים, תוך שמירת מרחק של 30 מיקרומטר) נרכשו בכל נקודת זמן 30. אלה נבחרו ברחבי מישור המוקד של הקצה הקדמי של mesoderm presomitic. משך ACQ זמן לשגותuisition נקבע ל -50 שעות, ומרווחי הדמיה של 3, 4, או 10 דקות נבחרו 31. איכות רכישת הזמן לשגות עשויה להשתפר באמצעות refocusing כל 5 – hr 10 ו מגדיר מחדש את Z- המחסנית סביב מטוס המוקד האופטימלי החדש. בסוף הניסוי, כל הזמן-הסדרה נערכה באופן ידני, וקבוצות משנה של תמונות המכילות את Z- מטוס עם המוקד הטוב ביותר נוצרה והצילה לתיקייה נפרדת 32. תת אלה של התמונות היו פעם תפורות ליצור זמן-סדרה שלמה של תמונות עם פוקוס אופטימלי. האריחים של כל תמונה של סדרת-במשרה מלאה זה נתפרו התמזגו יחד ללא צורך בתיקון הצללה 30, ומסגרות זמן לשגות יוצאו כמו JPEG-תמונות של 100% בגודל 95% דחיסה 32. מסגרות זמן לשגות יובאו כרצף תמונה לתוך תוכנת עריכת וידאו מקצועית. מתקרב 100% המפורטים התייצבו, והניגוד הכולל הותאם לטעמו שלנו. The-נסיגות בפעם האחרונה היו לקודדד עם codec H.264 וייצא במיכלים MPEG-4. סרטים מוצגים בקצב מסגרת של 15 מסגרות / שנייה (fps) ו רזולוציה של 1,920 x 1,080 פיקסלים. איור 2 מציג השוואה בין עובר בתרבות 1 EC (איור 2 א) ושני עוברים בתרבות כריך נייר הסינון השקוע, להיות אחד בצד גחון בתרבית עד (תרשים 2B) ואת הצד אחד הגבה האחר עד (איור 2 ג). כל העוברים היו גיל בהתאמה לשבעה שלב somite (HH9) 15 צלם עם רזולוציה זמנית של 4 דקות (איור 2 א 'וב') או 10 דקות (איור 2 ג). מסגרות נבחרות של 3 במרווחים hr מתוארים. תרבות EC (האיור 2 א) מותר הדמיה יציבה מאוד בשל העובר נח על אגר-חלבון יציב 1,33 תחתון. העובר כולו נשאר במישור אחד מוקדי ברחבי tהוא זמן לשגות כולו. זה יכול להיות מועיל עבור ניסויים קצרים (כמה שעות) ועובר מאוד מוקדם, אבל זה מגיע עם כליאה חזקה של העובר-בכיוון z, ואולי פוגע פיתוח תלת הממדים המוצלח שלה בטווח הארוך. בהתחלה, כליאת ביאה רק השטחה לרוחב קלה של הראש של העובר לעומת עובר בתרבית כריך נייר פילטר השקוע עם צד הגחון שלה עד (השווה איור 2 א ו -2 ב 0 hr). מאוחר יותר, התנועה הסיבובית של ראש נפגמה (איור 2 א – 21 שעות) ואת פעימות הלב האט. זרימת הדם כמעט הפסיק. ראה משלימים סרט 1 בפעם לשגות המלאה של העובר בתרבות EC. הפנל העליון בסרט הזה מציג סקירה מלאה של העובר, בעוד הפנל על השמאלית התחתונה מדמיין את התפתחות הלב ברזולוציה מלאה. פילוח של mesoderm presomitic לתוך somites יכול להיות seen בפירוט בצד הימני התחתון. עוברים את הכריך נייר פילטר שקוע, מצד שני, היו מוגבלים התרחבות תלת ממדי שלהם רק על ידי המתח הטבעי של הקרומים המקיפים אותם. הם יכולים להיות מתורבתים גם עם הגחון שלהם (התרשים 2B) או הגבה כלפי מעלה (איור 2 ג). כך או כך, את העוברים הראו somitogenesis הרציפה, וראשיהם פנו. הם פתחו כפפו גולגולת צוואר רחם ואת זרימת דם פונקציונלית. שניהם עוברים את כריך נייר פילטר הם צלמו עם התמקדות mesoderm הסגמנטציה, כך חלקים של הראש נע בהדרגה מחוץ לפוקוס כמו העוברים גדלו, מעובים, ומחלים לפנות, ואילו חלק הפילוח של mesoderm נשאר בפוקוס (השווה איור 2B ו 2C ב 21 שעות ל -27 שעות). סרט משלימה 2 מציג את הסרט זמן לשגות מלאה של העובר מתוארבאיור 2B. מרווח ההדמיה היה 4 דקות. הפנל העליון של הסרט הזה מציג סקירה מלאה של העובר. ההתפתחות של העובר הייתה צלמה ברציפות מעל 46 שעות, אך לאחר כ -30 שעות, התמקדות mesoderm הפילוח לאיבוד בשל העיבוי הכולל המפנה של הרקמה העוברית. הפנל השמאלי התחתון מציג את ההתפתחות המוקדמת של הלב ברזולוציה מלאה של מסגרות הזמן לשגות רכש. באמצעות היתוך של primordia הלב לזווג משני צידי קו האמצע, מבנה צינורי ישר כמעט נוצר, אשר לאחר מכן הוא מתחיל להכות וכיפוף ימינה. הפנל הימני התחתון מראה את somites ולאחרונה בנוי והקצה הקדמי של mesoderm presomitic ברזולוציה מלאה ועוקב היווצרות somites החדש לאורך זמן. סרט משלימה 3 מראה אחר העובר תרבותי צילמו בצד הגחון למעלה כריך נייר סינון שקוע. מרווח ההדמיה היה 4 דקות. סרט מכסה הפיתוח הדואר של העובר משלב HH5-6 לכ שלב 15 HH14, על כ 27 שעות של זמן ותרבות. הראש לקפל צורות ומתקדמות בדיעבד. צורות הלב מן primordia הדו-הצדדי, מתחילה לפעום, ומתכופפות ימינה. את somites שלושה כדי ארבעת הראשונים ליצור בו זמנית. somites נוסף יוצא מגוף ברצף מהקצה הקדמי של mesoderm presomitic. הפנל התחתון מראה את אזור הראש של העובר ברזולוציה מלאה, המאפשר התצפית של קפל ראש היווצרות לב מוקדם פירוט גבוה. בשל השקיפות של העובר, סגירת הצינור העצבי ניתן להבחין באזור הראש בעתיד. סרט 4 היווצרות somite מציג משלימה באותה העובר ברזולוציה מלאה לאורך זמן הדמיה מלאה הפאנל התחתון. סרט משלימה 5 מראה את זמן לשגות מלאה של למעלה בצד תרבותי הגבי העובר (איור 2 ג). מרווח ההדמיה היה 10 דקות. בעוד uppאה לוח מציג את התפתחות העובר משבע הבמה somite (HH9) לכ הבמה HH16-17, הפאנל התחתון חתוכה להצגת שינויים מורפולוגיים במוח מוקדם בשלב זה ברזולוציה מלאה. הנפיחות המקומית של הצינור העצבי ניתן לצפות, המוביל אל הממד האזורי של המוח הקדמי, המוח התיכון, ו למוח האחורי, אשר יחלק לחמש אזורי המשנה של המוח העוברי ב בשלבים מאוחרים יותר 13. בנוסף, הצמיחה של השלפוחית ​​האופטית ניתן לראות בבירור. לאחר כ 30 שעות בתרבות, העובר גוסס. כדי להציג את התאימות של כריך נייר פילטר השקוע עם מניפולציות מייקרו, כמה microbeads פוליסטירן (~ 40 מיקרומטר קוטר) הושתלו לתוך או בקרבת והמזודרם presomitic של עובר עוף בתרבות כריך נייר השקוע המסננת. Microbeads נשטפו PBS להסיר חיץ אחסון implanטד לפני המכסה את מדיום התרבות עם שכבת שמן מינרלי אור (השווה לשלב 2.18 של סעיף הפרוטוקול). פיפטה זכוכית פסטר שמשה להעברת החרוזים אל פני השטח העוברים, בהשגחת הדרך העינית של המיקרוסקופ. חמישה חורים שנוצרו endoderm ידי גירוד אותו בעדינות עם מחט דיקור. כלי מחוייט בצורת J, נוצרו על ידי מתיחה וכיפוף פיפטה פסטר זכוכית בתוך להבה, שמש כדי לתפעל את החרוזים ולדחוף אותם בזהירות לתוך החורים עד שהם הפכו נייחים. שלושה חורים היו מלאים חרוז אחד אחד (איור 3 א – 0 שעה ו 3B *) ושני חורים עם שני חרוזים כל אחת (איור 3 א – 0 hr). מופעים איור 3 א, ב שנבחר מסגרות זמן לשגות, התפתחות העובר חומוס לאחר ההשתלה microsurgical של חרוזים. שלושה חרוזים שולבו בהצלחה לתוך הרקמה במקום הרצוי, ותנועתם הייתה צלמה עלבמהלך הניסוי בפירוט גבוה (איור 3 ב). ההתפתחות של העובר לא נראה כי הוא פגום על ידי מניפולציה או נוכחות של חרוזים. ראה משלימה סרט 6 עבור הסרט זמן לשגות מלא. מרווח ההדמיה היה 4 דקות. איור 3: זמן לשגות הדמיה לאחר Microbead השרשה. הוכחה של עיקרון ניסוי מראה את התאימות של כריך נייר פילטר השקוע עם השתלת microbead. ראש העובר נמצא בצד השמאל, אבל זה לא היה צלם במהלך הניסוי הזה. תמונות נרכשו באמצעות תאורה darkfield. (א) נבחר זמן לשגות מסגרות מראה העובר מניפולציות על 3 במרווחים שעות לאחר ההשתלה של שבעה microbeads (~ 40 מיקרומטר קוטר). העובר מוארך ברציפות נוצר somit נוסףes. שלושה חרוזים נראים חובר כראוי ועברו מדיאלית עם זרם הרקמות מעל 18 שעות של התרבות. חרוזי הארבעה אחרים יצאו מחוריהם בין 6 ל 9 שעות של תרבות ונסחפו בדיעבד. (ב) תצוגה מפורטת של שלושת החרוזים היחידים (B1 כדי B3) מושתל לתוך mesoderm presomitic לתחילת הניסוי (0 hr, B *) ואחרי 12 שעות של דגירה (B **). המספר של somites רק יוצרי מותווה (S9 ב * B ו- S18 ב B **). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. משלימה סרט 1: EC-תרבות הגחון כלפי מעלה. העובר בתרבות 1 EC, בצד הגחון בתרבית עד, משבע הבמה somite (HH9) 15 ואילך על botto אגר-חלבוןמ 1,33. מרווח ההדמיה היה 4 דקות. השעה ביחס מוצגת בפינה השמאלית העליונה. תמונות באיכות גבוהה יכולות להירכש, כמו העובר היה כלוא בתוך-בכיוון z. אחרי 21 שעות, את פעימות הלב ואת זרימת הדם נעצרו כמעט ואת העובר התחיל להתפורר. הפאנל העליון מציגה סקירה בגודל שונה של העובר, ואילו הפנלים התחתונים לדמיין פיתוח הלב (פאנל משמאל) ופילוח של mesoderm presomitic (פאנל מימין) ברזולוציה מלאה (100% זום). (קליק ימני להוריד). סרט משלימה 2: למעלה בצד הגחון סנדוויץ נייר סינון שקוע. העובר בתרבית כריך נייר השקוע משבע במת somite (HH9) 15 ואילך, sid הגחוןדואר פונה כלפי מעלה. מרווח ההדמיה היה 4 דקות. השעה ביחס מוצגת בפינה השמאלית העליונה ב שעה ו דקות, הפעלה מחדש לאחר 24 שעות. הפאנל העליון מציגה סקירה בגודל שונה של התפתחות העובר מעל 46 שעות, בזו אחר זו. הפנל השמאלי התחתון מדמיין פיתוח לב מוקדם במהלך רכישת תמונה 10 השעות של הראשונות ברזולוציה מלאה (100% זום). הפנל הימני התחתון המתארות פילוח mesoderm פני כ 30 שעות של פיתוח ברזולוציה מלאה (100% זום) עד המיקוד הולך לאיבוד בשל עיבוי כולל מפנה של רקמה עוברית. (קליק ימני להוריד). סרט משלימה 3: גיבוש מקפלים ראש. עובר תרבותי גחון כלפי מעלה ב כריך נייר פילטר השקוע מן הואאד-תהליך / ראש-פי שלב (HH5-6) 15 לכ בשלב 22-somite (HH14) 15 על בערך 27 שעות של זמן ותרבות. מרווח ההדמיה היה 4 דקות. השעה ביחס מוצגת בפינה השמאלית העליונה H ו דקות, הפעלה מחדש לאחר 24 שעות. הפאנל העליון מציגה סקירה בגודל שונה של התפתחות העובר. הפאנל התחתון מציג את אזור הראש של העובר ברזולוציה מלאה (100% זום). ההיווצרות של קפל הראש והלב מוקדם סגירת הצינור העצבי ניתן לצפות. (קליק ימני להוריד). סרט משלימה 4: somitogenesis. עובר תרבותי גחון כלפי מעלה ב כריך נייר פילטר השקוע המשלב חזיתית התהליך / הראש-פי (HH5-6) 15כ בשלב 22-somite (HH14) 15 על בערך 27 שעות של זמן ותרבות. מרווח ההדמיה היה 4 דקות. השעה ביחס מוצגת בפינה השמאלית העליונה H ו דקות, הפעלה מחדש לאחר 24 שעות. הפאנל העליון מציגה סקירה בגודל שונה של התפתחות העובר. הפאנל התחתון מתאר את המזודרם הפרקסיאלית פילוח ברזולוציה מלאה (100% זום). (קליק ימני להוריד). סרט משלימה 5: למעלה בצד הגבה סנדוויץ נייר סינון שקוע. עובר הגבה תרבותי כלפי מעלה ב כריך נייר פילטר השקוע משבע במת somite (HH9) 15 לכ במת HH16-17 15. מרווח ההדמיה היה 10 דקות. השעה ביחס מוצגתבפינה השמאלית העליונה ב שעה ו דקות, הפעלה מחדש לאחר 24 שעות. הפאנל העליון מציגה סקירה בגודל שונה של התפתחות העובר. הפאנל התחתון מתאר שינויים מורפולוגיים במוח מוקדם ברזולוציה גבוהה יותר (100% זום). העובר מת לאחר כ -30 שעות בתרבות. (קליק ימני להוריד). משלימה סרט 6: microbeads מושתלים. העובר בצד הגחון בתרבית בתוך כריך נייר פילטר מתחת למים במשך כ -19 שעות, החל מהשעה תשע הבמה somite (HH9-10) 15. מרווח ההדמיה היה 4 דקות. השעה ביחס מוצגת בפינה השמאלית העליונה H ו דקות. הפנל העליון מציג סקירה בגודל שונה של אזור הזנב עם שבעה microbeads מושתל לתוך יחסי הציבורmesoderm esomitic. הפאנל התחתון מראה את האזור עם microbeads מושתל ברזולוציה גבוהה יותר (100% זום). (קליק ימני להוריד).

Discussion

כתוצאת גרסה חדשה של תרבות 1 והמבוססת EC, כריך נייר פילטר השקוע מקל על רכישת סרטי brightfield ו הזמן לשגות darkfield לטווח ארוך של האקס עובר אפרוח מוקדם אובו ידי ביצוע חממה בטמפרטורה ו-לחות מבוקרות סביב המיקרוסקופ אפשר לוותר עליהן. במקום להיות מתורבת על התחתונה חצי מוצקה אגר-חלבון, העוברים מוחזקים שקועים לחלוטין בתוך מדיום תרבות פשוט המורכבת-מלוח PC ו חלבון רזה. אידוי איבוד חום הם מזעריים על ידי שכבה של שמן מינרלים צפה על גבי המדיום לתרבות. עובר יכול להיות מתורבת בקלות, או הגבו או למעלה בצד גחון, ללא הבדלים גלויים באיכות. כפי שניתן לראות כאן, עוברים את הכריך נייר פילטר שקוע נגישים להתערבויות מיקרו, כמו יישום של חרוזים ספוג מורפוגן. יישומים עתידיים כוללים דימות פלואורסצנטי חיים, microinjections ו electroporation, ואת גן השתקה לאמאnipulate וללמוד מגוון רחב של אירועים המוךפו"גנטי שהולכים במהלך הגחון (למשל, לב somitogenesis מוקדם) ועל גב (למשל, gastrulation מאוחר, סגירת צינור עצבית, והמוח מוקדם) פיתוח. טיפול תרופתי תלוי זמן אינו ריאלי אם צלחת פטרי המכילה את כריך נייר פילטר מוחלפת בתא זלוף, המאפשר החלפת בינוני התרבות מתחת לשכבת שמן מינרלים. כריך נייר פילטר השקוע יפתח פוטנציאל ההדמיה המלא שלה בשילוב עם הדמיה מבוססת ליזר (כוללים מיקרוסקופ אור גיליון) ויעדי טבילה.

כמה קשיים עם הכנת כריך נייר פילטר השקוע יטופלו בפסקאות הבאות. למרות שזה דורש כמות של אימון מתונה בלבד להעביר עובר מן החלמון לתוך כריך נייר פילטר, כמה צעדים עדיין יכולים להשפיע על האיכות עובר באופן משמעותי בתרבות. לפני מוביל נייר סינון הואהניח על החלמון, קרום vitelline סביב העובר צריך להיות משוחרר מכל חלבון עבה. רק אז יהיה הקשר בין נייר הסינון ואת קרום vitelline להיות חזק מספיק כדי לעמוד הכביסה ב-מלוח PC. העיתון המסנן נושא את העובר צריך לחצות את הממשק הנוזל / אוויר כמה שפחות כדי למזער את המתח על ממברנות. לאחר שהובא אל-מלוח PC לשטיפה, המוביל נייר הסינון כולה צריך להישאר שקוע לחלוטין בכל העת. השעה באמבטית PC-מלוח חייבת להיות מוגבלת לכ 30 – 60 שניות, כמו קרום vitelline יתחיל שחרור מעיתון הסינון. ובכל זאת, ניקוי של העובר צריך להיות מוצא להורג באופן יסודי ביותר, כמו שאריות חלמון יהיה מאוחר לטשטש את התצוגה של העובר. במהלך הכביסה, לא להצביע הנחל מן פיפטה העברת ישירות על העובר, אבל תמיד רדיאלית ממנו. לאחר הסרת העובר מן-המלוח PC, הקפד להחזיק את נייר הסינון אופקי כדי למזערמתח על ממברנות העובריים. לאחר מכן, לייצב את העובר עם מוביל נייר הסינון השני. ברגע מוביל נייר הסינון השני מושם, להימנע מיצירת מתח לרוחב, אשר יכול להעביר את נושאי נייר סינון ביחס לזה ולקרוע את הקרומים העובריים. כאשר כריך נייר הסינון מובא לתוך מדיום התרבות, הוא צריך גם לחצות את ממשק האוויר / נוזל רק פעם אחת כדי למזער מתח על ממברנות. הזוג השני של טבעות נירוסטה המשמשות לייצב את כריך נייר פילטר מלמעלה צריך להיות ממוקם מאוד לאט לאט ובלי שום לחץ לצמצם דחיסה של הקרומים העובריים. קרעים קטנים של האזור opaca של העובר בדרך כלל לרפא במהלך השעה הראשונה של תרבות, אבל עובר פגום יכול ותמיד צריך להיות מוחלף על ידי מדגם חדש לפני שכבת שמן הוא pipetted על גבי המדיום לתרבות.

כדי לקלוט תמונה של עובר כולו או דגימות מרובות עבור ברזולוציה גבוהה זמן לשגות סרטים, המיקרופוןroscope חייב להיות מצויד XY-הבמה ממונע, שבשליטת תוכנת מיקרוסקופ. זה הוא בעל חשיבות מכרעת כדי לקבל את מהלך XY הבמה עם מהירות מינימאלית, כדי למנוע פגיעה את העוברים ואת המערבולות במדיום התרבות והשמן, אשר יקטינו את איכות התמונה. לרכישה בסרטי הזמן לשגות שהוצגו כאן, xy-הבמה הממונע עבר עם מהירות של כ 1.75 מ"מ / sec. בעתיד, הדמיה יכולה להשתפר עוד יותר על ידי ההעברה הראשונה בשלב למיקום הרצוי והרכישה את התמונה לאחר תקופת מנוחה קצרה לתת תנודות מערבולות להתפוגג.

כהגבלה, משתמשים פוטנציאליים צריכים להיות מודעים של מרחק העבודה הארוך יחסית (כ 1 סנטימטר) דרושי שיטת התרבות הזאת אם מיקרוסקופ זקוף ללא מטרות טבילה משמש. תוצאות מרחק עבודה זו מהשכבה של בינוניות של שמן מינרלי על גבי העובר. בצלחת 6 ס"מ פטרי, שכבת שמן יש thicknesים של כ 1 – 1.5 מ"מ, ואת העובר הוא שקוע כ 4 מ"מ עמוק בתוך המדיום לתרבות. תלוי בקוטר של המטרה, בקצה העליון של המנה 6 ס"מ פטרי יכול גם להגביל את הגישה העובר. זה אפשר לעקוף באמצעות מנה גדולה יותר.

מרחק העבודה מלמעלה יכול להיות מופחת מעט על ידי מזעור העוביים של השכבות הנוזלות. בנוסף, מרחק העבודה מלמטה יכול להיות ממוזער על ידי הביא את העובר בהמשך לחלק התחתון של צלחת פטרי הקטנת העובי של חלון הזכוכית של הכוס המחוממת. בעוד פרוטוקול מותאם לעבודה עם מיקרוסקופ זום מרחק עבודה ארוך, זקוף, זה יכול להיות מצויד מיקרוסקופ הפוכה גם כן. משתמשים עתידיים צריכים לזכור כי השריית העובר עמוקה מדי במדיום התרבות עלולה להוביל O 2 -diffusion בעיות, למרות מציעים ניסויים ראשוניים כי דיפוזיה מוגבלת לא נראית להיות probלם, כל עוד העובר מוקף מאגר מספיק גדול של מדיום תרבות נייר הסינון הדחוק לא נלחץ אל החלק התחתון של צלחת פטרי.

מגבלה נוספת היא בקרת הטמפרטורה. על ידי התאמת הטמפרטורה של הבקר עבור הכוס המחוממת ל -40 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה בטווח הבינוני equilibrates 37.5 ° C ברחבי עובר כאשר המדיום מכוסה שמן מינרלים. זה מראה כי כמה אנרגיה הולכת לאיבוד בין החלק התחתון של הכוס, שבו גופי החימום ואת חיישן הטמפרטורה ממוקמות, ואת המיקום של העוברים. בקרת הטמפרטורה יכולה להיות מותאמת על ידי העברת חיישן הפיזור מחדש של גופי החימום.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים תמיכה כספית ממענק ZonMW-Vici 918.11.635 (הולנד). המחברים מבקשים להודות חנות כלי של אמסטרדם Vrije Universiteit לעצות מעשיות שלהם לייצור הרכיבים להתקנה Jarno Voortman של Carl Zeiss הולנד עבור עצות מועילות על מיקרוסקופיה. Marjolein Blaauboer היה תמיכה גדולה עוד להתייחס באופן ביקורתי על מספר טיוטות של כתב היד.

Materials

Milli-Q Reference Water Purification System Millipore Z00QSV0WW 
Duran laboratory bottles, with caps, 1L Sigma-Aldrich/Duran Z305200-10EA 
Name Company Catalog Number Comments
Solution A
NaCl Merck Millipore 1064041000
KCl Merck Millipore 1049361000
CaCl2 H2O Merck Millipore 1023821000
MgCl2.6H2O Merck/Sigma-Aldrich 13152-1KG-D 
Name Company Catalog Number Comments
Solution B
Na2HPO4.2H2O Merck 1065801000
NaH2PO4.2H2O Merck 1063420250
Name Company Catalog Number Comments
Whatman qualitative filter paper, Grade 595 Sigma-Aldrich 10311611
Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130W, wavelength 10.6 µm Micro Lasersystems
Tork Extra Soft Facial Tissues Tork 140280
Latex gloves Sigma-Aldrich Z645613
EMDAMED EMDA 300.131
Transfer pipettes Sigma-Aldrich Z350613
VWR WITG5.480.003
accu-jet pro Pipette Controller BrandTech Scientific 26332
Serological plastic pipettes, 25mL Sigma-Aldrich CLS4251
Plastic document sleeves
Egg incubator – Incubator mod. Cip Cip 40 Fiem
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) Drost BV (Loosdrecht, NL)
10 cm Tissue culture dishes Sigma-Aldrich P5731
Greiner Bio-one 664160
6 cm Petri dishes Sigma-Aldrich P5481
50ml Centrifuge tubes , Greiner centrifuge tubes  or Cellstar tubes Sigma-Aldrich T2318
greiner bio-one 227261
Name Company Catalog Number Comments
Stainless steel rings, custom-made
Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness
Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring
Nail scissors
Forceps, Dumont #5, Inox Fine Science Tools , F.S.T. 11251-20
Fine, really sharp scissors for cutting filter paper VWR 21-102
M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil Sigma-Aldrich CAS Number 8042-47-5
Name Company Catalog Number Comments
Agar bottoms for EC culture
Agarose Sigma-Aldrich A9539 SIGMA
NaCl Sigma-Aldrich S7653 SIGMA-ALDRICH
Name Company Catalog Number Comments
Microbead implantation
Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) Polysciences, Inc. 16905-1
Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30mm SEIRIN  type J, No.02, 0.12x30mm
PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023 
Name Company Catalog Number Comments
Temperature controlled beaker
RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M Omega RTD-850M
Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M Omega HSRTD-3-100-A-1M
Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 Omega EXTT-3CU-26S-50
3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M Omega MTP-U-M
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P Omega KHLV-103/(10)-P
Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC Omega CNi16D24-C4EIT-DC
Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)
Name Company Catalog Number Comments
Microscope setup
Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN Carl Zeiss AG 495010-0009-000
Objective PlanNeoFluar Z 1.0x/0.25 FWD 56mm Carl Zeiss AG 435281-9100-000
Manual Rotary Control MARC Carl Zeiss AG 435604-0000-000
Transillumination top 450 mot Carl Zeiss AG 435500-9000-000
Motorized measuring stage S 150×100 mot; CAN (D) Carl Zeiss AG 435465-9020-000
Insert plate S, glass 237x157x3mm (D) Carl Zeiss AG 435465-9053-000
Controller EMS 3 Carl Zeiss AG 435610-9010-000
System Control Panel SYCOP 3 Carl Zeiss AG 435611-9010-000
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera Hamamatsu C11440-22CU
Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual Carl Zeiss AG 490004-0025-000
Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US Carl Zeiss AG 410373-0200-000
LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" Carl Zeiss AG 410350-2403-000 not available anymore
ZEN pro 2012 Hardware License key Carl Zeiss AG 410135-1002-120 not available anymore
ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key Carl Zeiss AG 410136-1045-110
ZEN module Z Stack Carl Zeiss AG 410136-0030-110
ZEN Module Tiles/ Positions Carl Zeiss AG 410136-1025-110
ZEN Module Time Lapse Carl Zeiss AG 410136-1031-110
ZEN Module Experiment Designer Carl Zeiss AG 410136-1022-110
ZEN Desk 2012 Hardware License Key Carl Zeiss AG 410135-1004-120 not available anymore
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Dev. Dyn. 220 (3), 284-289 (2001).
  2. Rozbicki, E., et al. Myosin-II-mediated cell shape changes and cell intercalation contribute to primitive streak formation. Nat. Cell Biol. 17 (4), 397-408 (2015).
  3. Smith, J. L., Schoenwolf, G. C. Neurulation: Coming to closure. Trends Neurosci. 20 (97), 510-517 (1997).
  4. Schoenwolf, G. C., Sheard, P. Shaping and bending of the avian neural plate as analysed with a fluorescent-histochemical marker. Development. 105 (1), 17-25 (1989).
  5. Colas, J. F., Schoenwolf, G. C. Towards a cellular and molecular understanding of neurulation. Dev. Dyn. 221 (2), 117-145 (2001).
  6. Pourquié, O. The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies. Mech. Dev. 121 (9), 1069-1079 (2004).
  7. Maenner, J. Cardiac looping in the chick embryo: A morphological review with special reference to terminological and biomechanical aspects of the looping process. Anat. Rec. 259 (3), 248-262 (2000).
  8. Wittig, J. G., Münsterberg, A. The Early Stages of Heart Development Insights from Chicken Embryos. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 3 (2), (2016).
  9. Layer, P. G., Alber, R. Patterning of chick brain vesicles as revealed by peanut agglutinin and cholinesterases. Development. 109 (3), 613-624 (1990).
  10. Nakamura, H., Nakano, K. E., Igawa, H. H., Takagi, S., Fujisawa, H. Plasticity and rigidity of differentiation of brain vesicles studied in quail-chick chimeras. Cell Differ. 19 (3), 187-193 (1986).
  11. Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. Fate map of the chick embryo neural tube. Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).
  12. Andermatt, I., Stoeckli, E. T. RNAi-based gene silencing in chicken brain development. Methods Mol. Biol. 1082, 253-266 (2014).
  13. Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).
  14. Endo, Y. Chick embryo culture and electroporation. Curr. Protoc. Cell Biol. , Unit 19.15 (2012).
  15. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
  16. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In Ovo Live Imaging of Avian Embryos. Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (6), (2010).
  17. Borwompinyo, S., Brake, J., Mozdziak, P. E., Petitte, J. N. Culture of chicken embryos in surrogate eggshells. Poult Sci. 84 (9), 1477-1482 (2005).
  18. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. J. Vis. Exp. (44), e2154 (2010).
  19. Auerbach, R., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41 (2), 391-394 (1974).
  20. New, D. A. T. A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morphol. 3 (4), 320-331 (1955).
  21. Stern, C. D., Bachvarova, R. Early chick embryos in vitro. Int. J. Dev. Biol. 41 (2), 379-387 (1997).
  22. Nagai, H., Lin, M. C., Sheng, G. A modified cornish pasty method for ex ovo culture of the chick embryo. Genesis. 49 (1), 46-52 (2011).
  23. Connolly, D., McNaugbton, L. A., Krumlauf, R., Cooke, J. Improved in vitro development of the chick embryo using roller-tube culture. Trends Genet. 11 (7), 259-260 (1995).
  24. Rupp, P. A., Rongish, B. J., Czirok, A., Little, C. D. Culturing of avian embryos for time-lapse imaging. Biotechniques. 34 (2), 274-278 (2003).
  25. Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS One. 4 (10), e7429 (2009).
  26. Nagai, H., Sezaki, M., Nakamura, H., Sheng, G. Extending the limits of avian embryo culture with the modified Cornish pasty and whole-embryo transplantation methods. Methods. 66 (3), 441-446 (2014).
  27. Pannett, C., Compton, A. The Cultivation of Tissues in Saline Embryonic Juice. Lancet. 203 (5243), 381-384 (1924).
  28. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3 (3), 419-426 (2008).
  29. . GmbH ZEN 2 – (blue edition) – Software Guide Available from: https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf (2014)
  30. Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. Culture of Avian Embryos. Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).

Tags

Chick EmbryosEx Ovo CultureTime-lapse ImagingNeurulationGastrulationSomitogenesisPannett-Compton SalineAlbumenFilter Paper CarrierVitelline MembraneYolk

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (118), e54636, doi:10.3791/54636 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image