JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

والمغمورة ساندويتش ورقة مرشح للالمدى الطويل<em> البيضة السابقين</em> الوقت الفاصل بين التصوير من وقت مبكر الفرخ الأجنة

Published: December 28, 2016
doi:
10.3791/54636
, ,
1Department of Orthopaedic Surgery, VU University Medical Center Amsterdam,MOVE Research Institute Amsterdam, 2Department of Anatomy, Embryology & Physiology,Academic Medical Center Amsterdam

Summary

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Abstract

نظرا لتوافرها، منخفضة التكلفة، والهندسة المسطحة، والشفافية، وأصبحت البيضة السابقين الجنين الفرخ نموذج حيواني الفقاريات الرئيسي للدراسة الأحداث التخلق، مثل تكون المعيدة 2، تكون العصيبة 3-5، تكون الجسيدات 6، القلب الانحناء 7، 8، والدماغ تشكيل 9-13، خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر. المفتاح لفهم عمليات التخلق هو لمتابعتها بشكل حيوي بواسطة الوقت الفاصل بين التصوير. وقد تم الحصول على الوقت الفاصل بين الأفلام من فرخ مرحلة التطور الجنيني البيضة السابقين إما تقتصر على نوافذ زمنية قصيرة أو للحاجة إلى حاضنة للسيطرة على درجة الحرارة والرطوبة حول الجنين 14. هنا، نقدم تقنية جديدة لفرخ ثقافة أجنة البيضة السابقين عالية الدقة الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام تنتقل عن طريق المجهر الضوئي. والمغمورة ورقة مرشح شطيرة هو البديل للمرشح ميتاليك رقة الناقل راسخةIQUE (EC-الثقافة) (1) ويسمح للزراعة من افراخ الدجاج من دون الحاجة إلى وجود غرفة المناخ. محصورة الجنين بين حاملتي ورق الترشيح متطابقة ويتم الاحتفاظ مغمورة تماما في والمتوسطة التحكم في درجة حرارته بسيط طبقة من الزيوت المعدنية خفيفة مغطاة. بدءا من المرحلة البدائية متتالية (همبرغر هاملتون المرحلة 5، HH5) 15 تصل إلى ما لا يقل عن المرحلة 28 الجسيدة (HH16) 15، يمكن أن الأجنة يكون مثقف إما على بطني أو ظهري حتى الجانب. وهذا يسمح للشراء الوقت الفاصل بين الأفلام التي تغطي نحو 30 ساعة من التطور الجنيني. وتظهر الممثلة إطارات الوقت الفاصل بين والأفلام. تتم مقارنة الأجنة شكليا إلى الجنين مثقف في القياسية EC-الثقافة.

يوفر المغمورة ورقة مرشح شطيرة بيئة مستقرة لدراسة ظهري المبكر وعمليات التخلق البطنية. كما أنه يسمح للتصوير مضان الحية وmicromanipulations، مثل جراحة، عفريت حبةlantation، حقن مكروي، إسكات الجينات، و electroporation، ولديها امكانات قوية لتكون جنبا إلى جنب مع أهداف الغمر للتصوير باستخدام الليزر (بما في ذلك الفحص المجهري ورقة ضوء).

Introduction

وقد فتنت مرحلة التطور الجنيني الإنسان منذ بداية التاريخ. كيف بنية ومورفولوجية للجنين وضع بطريقة الزمانية والمكانية واضحة المعالم؟ أصبح الجنين الفرخ واحدة من النماذج الحيوانية الفقارية الكلاسيكية للمرحلة التطور الجنيني لعدة أسباب: وهي متاحة بسهولة، وغير مكلفة وشفافة في مراحلها المبكرة، ويمكن الوصول إليها عن التلاعب التجريبية، لأنها تتطور خارج الأم. وعلاوة على ذلك، ولديه هندسة مسطحة تقريبا خلال أحداث التخلق في وقت مبكر، مثل القلب وتشكيل الدماغ، تكون المعيدة، تكون العصيبة، وتكون الجسيدات 15.

يمكن فهم عمليات التخلق أفضل إذا تم دراستها بشكل حيوي، مثل من خلال الاستحواذ على الوقت الفاصل بين الصور. الجنين الفرخ يمكن تصور في البيضة 16 ولكن يصعب الوصول إليها عن التلاعب التجريبية والرؤية المحدودة للتصوير ضوء انتقال المجهر. ولذلك، قطعوقد اقترحت أساليب القاعدة لأجنة ثقافة كتكوت البيضة السابقين، سواء في النظم الثقافة صفار كلها 13،17 – 19 أو الثقافات يزدرع 1،20 – 23. في النظم الثقافة صفار البيض كله، يبقى الجنين على رأس صفار سليمة، ويتم نقل المحتوى كله من البيض إلى حاوية أخرى للحضانة. هذه الحاوية يمكن أن تكون بديلة قشرة البيضة 17، طبق بيتري 19، أو أرجوحة مصنوعة من البلاستيك تتشبث التفاف 13،18. الأجنة في الثقافات الصفار كلها يمكن أن يكون مثاليا مثقف حتى الفقس ويمكن الوصول إليها لmicromanipulations. هذه التقنيات هي مفيدة بشكل خاص لدراسة تطور الأجنة بعد الشروع في الدورة الدموية (مما يزيد من النقيض)، في حين لا تزال الأجنة الشابة الصعب تصور. هذه الأجنة المبكرة يمكن تصوير أفضل إذا تم رفعه هم من صفار البيض ومثقف كما هو الحال في المختبر إإكسبلنتس. وإإكسبلنتس يمكن الوصول إليها بسهولة عن تجربةتتطلب آل التلاعب ومساحة أقل للزراعة. لسنوات عديدة، كانت تقنية دينيس الجديد رائدة في عام 1955 وتبايناتها المعايير الذهبية وسائل الثقافة يزدرع لافراخ الدجاج، مما يجعل الجنين الوصول للفحص المجهري الوقت الفاصل بين والتدخلات المجهرية 20،21. وعلى الرغم من نجاحها الكبير، تقنية الجديدة هي شاقة وتستغرق وقتا طويلا نسبيا. غالبا ما يفصل الأريمة عندما الغشاء المحي، تحمل الأريمة، وامتدت حول حلقة الزجاج لتحقيق توتر مناسبة 1. وعلاوة على ذلك، فإن الجنين لا يمكن إلا أن يكون المثقف مع لبطني حتى الجانب. ثقافة EC (في وقت مبكر الفرخ)، وهي تقنية أكثر حداثة وضعتها تشابمان وCOLLIGNON 1، تلتف تمتد من الغشاء المحي باستخدام ورقة الناقل مرشح مع فتحة المركزية. وتعلق ورقة الترشيح إلى الغشاء المحي، وبالتالي الحفاظ على التوتر الطبيعي، ويحيط الجنين مثل إطار الصورة 1.الأجنة ثم تربيتها على أسفل أجار زلال، وعادة مع من بطني حتى الجانب. زراعة الظهري حتى الجانب يبدو ممكنا إلا للأجنة في HH8 15 وكبار السن. وقد تكيفت العديد من المجموعات ورقة الناقل مرشح لاحتياجاتهم، مثل استبدال أسفل أجار زلال مع دعم المصنوعة من الألياف خياطة الجراحية 24 أو الكولاجين المغلفة غشاء 25. في كثير من الأحيان، تتعرض الأجنة مثقف مع تقنية الجديدة أو مع الثقافة الأوروبية، مع الظهرية أو السطح البطني في الهواء لتسهيل انتشار الأوكسجين 1،20. هذه الثقافات يزدرع لها أن تبقى في جو مرطب لتجنب التبخر من المتوسط ​​ولمنع الجنين من الجفاف. ويتحقق ذلك عن طريق احتضان الطبق مع ثقافة يزدرع في طبق بتري أكبر تحتوي على المناديل الورقية مبلل 1. اكتساب الوقت الفاصل بين الصور من هذه الأجنة يتطلب إما استخدام حاضنة المناخ التي تسيطر عليها في جميع أنحاء المجهر كله أو المزاجature التي تسيطر عليها حاوية مع غطاء ساخنة لمنع التكثيف في مسار الضوء (14). ومع ذلك، يمكن افراخ الدجاج أيضا تطوير البيضة السابقين مغمورة تماما في مستنبت كما الثقافات ورق الترشيح 25، تقع بين طبقة من الزيت المعدني الثقيل وزلال في تكييفها مع الأوضاع تقنية الجديدة 2،21، أو كما إإكسبلنتس الأريمة مطوية في "كورنيش فطيرة اللحم الثقافة "23،26، من دون اتصال مباشر مع الهواء.

والمغمورة ورقة مرشح شطيرة هو البديل الجديد من تقنية فلتر ورقة الناقل. من خلال الجمع بين المعرفة السابقة على زراعة الأجنة الفرخ البيضة السابقين، فإنه يجعل الحاضنة التي تسيطر عليها المناخ والغطاء ساخنة الاستغناء عنها. محصورة الجنين بين اثنين متطابقة فلتر (ليزر لقطع) ناقلات ورقة 24 ومثقف مغمورة تماما في مستنبت بسيطة (Pannett كومبتون المالحة 27،28 وزلال رقيقة في نسبة 3: 2) في درجة الحرارة للرقابة احتواءإيه. وهناك طبقة من الزيوت المعدنية الخفيفة تطفو على أعلى من المتوسط يمنع تبخر 2،21 ويقلل من فقدان الحرارة للبيئة. الجزء السفلي من وعاء يحتوي على زجاج النافذة، ويتم تنفيذ الإعداد كله على العمل لمسافات طويلة التكبير المجهر تستقيم. هذا الإعداد يسمح اكتساب عالية الدقة brightfield والساحة المظلمة الوقت الفاصل بين الأفلام حوالي 30 ساعة من التطور الجنيني، بدءا من أوائل مرحلة الشريط البدائي إلى مرحلة 28 الجسيدة (أي ما يعادل همبرغر هاملتون مراحل 5-16، HH5-16 ) 15. الأجنة يمكن تربيتها جيد على قدم المساواة مع من بطني أو ظهري حتى الجانب. لذلك، الأجنة يمكن الوصول إليها للمراقبة والتلاعب في بطني (على سبيل المثال، في وقت مبكر القلب 7،8 وتكون الجسيدات 6) والظهرية (على سبيل المثال، في وقت متأخر تكون المعيدة 2، العصبية أنبوب الإغلاق 3-5، والدماغ في وقت مبكر 9-13) التنمية. مرشح المغمورة ورقة شطيرة صrovides بيئة بسيطة ومستقرة لجراحة، زرع حبة، حقن مكروي، إسكات الجينات، والدراسات Electroporation لل. إمكانات التصوير ويمكن لها أن تكون دفعت أبعد من ذلك بكثير باستخدام التصوير القائم على الليزر (بما في ذلك الفحص المجهري للضوء ورقة) والأهداف الغمر.

Protocol

وقد جرت كافة الإجراءات التجريبية وفقا للتجارب هولندا على قانون الحيوانات. ملاحظة: يتم تعديل فلتر طريقة رقة شطيرة المغمورة من 1. 1. المغمورة تصفية إعداد ساندويتش ورقة Pannett كومبتون (PC) -saline 27،28 إعداد الحلول الأسهم ألف (1 لتر من عالى النقاء H 2 O، و 121 غرام من كلوريد الصوديوم، و 15.5 غرام من بوكل، 10.42 غرام من CaCl 2 · H 2 O، و 12.7 غرام من MgCl 2 · 6H 2 O) و (ب) (1 لتر من عالى النقاء H 2 O، 2.365 غرام من نا 2 هبو 4 · 2H 2 O، و0.188 غرام من ناه 2 ص 4 · 2H 2 O) في عبوات 1-L نظيفة. تخزينها في 4 درجات مئوية. إعداد 1 لتر من PC-المالحة عن طريق خلط 900 مل من عالى النقاء H 2 O مع 40 مل من محلول المخزون A و 60 مل من محلول المخزون ب (في هذا النظام لتجنب الأمطار). إعداد-PC المالحة الاب طازجةام الحلول الأسهم A و B كل أسبوع. ويمكن تخزين الحلول المالية عند 4 درجة مئوية لعدة أشهر: ملاحظة. التعقيم و / أو إضافة المضادات الحيوية أو antimycotics ليست ضرورية. حضانة بيض الدجاج الملقحة في حاضنة ترطيب، تضع البيض على جانبهم واحتضان لهم في 37.5 درجة مئوية حتى بلوغهم سن المرجوة. ملاحظة: مخزن البيض لم يعد من اسبوعين (ويفضل في 12-15 درجة مئوية) قبل التجربة، كما أن نسبة الفقس سوف تنخفض بشكل كبير ناقلات ورقة الترشيح (مقتبس من 1) إذا كان متوفرا، استخدام آلة القطع بالليزر لقطع حاملات ورق الترشيح على شكل الساعة الرملية من ورقة الترشيح سميكة (28 ملم × 22 ملم). تفتق عرض في منتصف الفترة من 22 ملم إلى 10.4 ملم. قطع فتحة بيضاوية المركزية (10.6 مم × 5.5 مم)، مع محور أطول من القطع الناقص الموجه بالتوازي مع الجانب الأكبر من الناقل ورق الترشيح (الشكل 1-M). اختياريا، وإعداد الاستنسل من الورق المقوى مع الأبعاد الصحيحة ونقل المخطط لها والتي من الفتحة المركزية على ورقة الترشيح سميكة باستخدام قلم رصاص. قطع الناقل ورق الترشيح باستخدام مقص غرامة. قطع حاملتي ورق الترشيح متطابقة عن كل جنين إلى أن explanted. إعداد إضافية حاملات ورق الترشيح كما احتياطية في حالة يضيع جنين خلال explanting. التحكم في درجة حرارته حمام الزيت (في يوم التجربة) ضع الكأس التي تسيطر عليها درجة الحرارة في وسط بمحركات XY-مرحلة من مراحل المجهر التكبير تستقيم وربط الكأس للتحكم في درجة الحرارة فيها. وضع أربع حلقات كبيرة الفولاذ المقاوم للصدأ (القطر الخارجي 30 ملم، 4 ملم في الطول و 1.5 ملم سمك الجدار) إلى 6 سم طبق بتري ليكون بمثابة الأوزان ووضع الطبق في منتصف الكأس التحكم في درجة حرارته. ملاحظة: هذا الطبق بيتري يخدم فقط كعنصر نائب لضبط LEVE النفطل. ملء كوب التحكم في درجة حرارته مع 130 مل من الزيوت المعدنية الخفيفة. ضبط مستوى الزيت إذا لزم الأمر بحيث ينتهي حوالي 3 مم أسفل الحافة العلوية للطبق بيتري 6 سم. إزالة 6 سم طبق بيتري من الكأس التي تسيطر عليها درجة الحرارة وضبط درجة الحرارة إلى 40 درجة مئوية. 2. المغمورة تصفية الإنتاج ساندويتش ورقة مستنبت (في يوم التجربة) صب 30 مل من PC-المالحة (كما أعد الخطوات 1.1.1 إلى 1.1.2) في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. إعداد أنبوب واحد 50 مل الطرد المركزي مليئة 30 مل من PC-المالحة لكل اثنين من الأجنة إلى أن explanted. بعناية الكراك البيض غير المحتضنة في 10 سم طبق بتري. حصاد زلال رقيقة عن طريق تحريك نقل ماصة بلاستيكية على طول الجدران من طبق بيتري ومص في زلال رقيقة. جمع 30 مل زلال رقيقة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل لكل اثنين من الأجنة إلى أن explanted. تأكد من الحصول سوى رهين زلال. ملاحظة: عادة 3-4 البيض تسمح حصاد حوالي 30 مل من زلال رقيقة. صب 20 مل من زلال رقيقة في كل جهاز كمبيوتر المالحة شغل 50 مل أنبوب الطرد المركزي (كما أعدت في الخطوة 2.1.1). خلط PC-المالحة مع زلال رقيقة من قلب بلطف الأنابيب عدة مرات. السماح لها تسوية لعدة دقائق، ومعرفة ما اذا كان الخليط، ودعا مستنبت من هنا فصاعدا، هو واضح. إذا مستنبت ليست واضحة، وإعداد الطازجة PC-المالحة من المحلول وحصاد زلال رقيقة جديدة. وضع حلقتين صغيرة الفولاذ المقاوم للصدأ (القطر الخارجي 20 ملم، 4 ملم في الطول و 1.5 ملم سمك الجدار، 6.5 الفجوة ملم في الحلبة) متباعدة مثل ممكن في العذبة 6 سم من البلاستيك طبق بتري وملء مع 22 مل من ثقافة متوسطة (كما أعد الخطوات 1.4.1 إلى 1.4.4) باستخدام ماصة بلاستيكية 25 مل (الشكل 1-H). تأكد من أن الحطام المتراكم على أعلى من المتوسط ​​يبقى في أنبوب الطرد المركزي. إزالة أي س الحطامص فقاعات من المتوسطة باستخدام ماصة نقل البلاستيكية. ملء 10 سم طبق بتري مع 75 مل من PC-المالحة (لاستخدامها في الخطوة 2.15). إزالة البيض من الحاضنة والسماح لها بقية على مقاعد البدلاء على جانبها لمدة 1 دقيقة للسماح للجنين يأتي إلى الجزء العلوي من صفار البيض. بعناية كسر البيض في طبق بتري (الشكل 1-A). نقع حافة قطعة من المناديل الورقية الجميلة في زلال سميكة وتوسيط الأريمة عن طريق سحب، إذا لزم الأمر. إزالة أكثر من زلال رقيقة وسميكة من طبق بيتري باستخدام ماصة نقل البلاستيك (مع طرف قطع لتسهيل امتصاص زلال سميكة). إنشاء إطار في زلال سميكة حول الجنين عن طريق محو بلطف بعيدا زلال سميكة مع قطعة من المناديل الورقية، والابتعاد عن المركز (الشكل 1-B). منع المناديل الورقية من الالتصاق على الغشاء المحي. باستخدام الملقط، وضع بعناية ورقة مرشح الناقل على VITEغشاء lline حول الجنين، مع محور أطول خط العرض فتحة بيضاوي الشكل على المحور الأمامي الخلفي للجنين (الشكل 1-C). قرصة طرف واحد من مقص الأظافر من خلال الغشاء المحي على مقربة من حاملة ورق الترشيح وقطع بسرعة حول ورقة الترشيح كله الناقل (الشكل 1-D). باستخدام الملقط، ورفع الناقل ورق الترشيح بعيدا عن صفار البيض في اتجاه مواز المائل إلى المحور الأمامي الخلفي للجنين (الشكل 1-E). تحويل الورق الناقل مرشح في جميع أنحاء لديك الجانب البطني للجنين على رأس ويغرق في PC-المالحة. تزج الناقل ورق الترشيح على طول المحور الأمامي الخلفي للجنين في اتجاه منحرف. التخلص من كل صفار البيض لا تزال تعلق الغشاء المحي والأريمة عن طريق تنظيف برفق مع PC-المالحة من ماصة نقل البلاستيك. حافظ على مجمل الناقل ورق الترشيح المغمورة فيمرات ليرة لبنانية (الشكل 1-F). إزالة الناقل ورق الترشيح من PC-المالحة على طول المحور الأمامي الخلفي للجنين في اتجاه منحرف وتخلص من السائل الزائد عن طريق اللمس حافة ورقة الناقل مرشح على ورقة الأنسجة. عقد ورقة الترشيح أفقيا، مع الجانب البطني للجنين مواجهة، ووضع ورقة الناقل مرشح آخر على رأس أول واحد، وذلك باستخدام الزوج الثاني من الملقط. يجب أن يتطابق مع فتحات بهم بالضبط، وبالتالي يقحم الجنين بين طبقتين من ورق الترشيح (الشكل 1-G). على الفور غمر شطيرة الناقل ورق الترشيح في مستنبت في اتجاه منحرف طول الأمامي الخلفي محور الجنين. وضعه في منطقة تمتد المسافة بين حلقات الفولاذ المقاوم للاثنين (الشكل 1-H). إصلاح ورقة الترشيح شطيرة من خلال وضع اثنين من حلقات الفولاذ المقاوم للمزيد من على رأس اثنين آخرين، والتأكد من أن فتحة مع البريديبقى mbryo كشفت تماما (الشكل 1-I). التحقق من مستوى المتوسط ​​وتأكد من أن الفاصل العلوي مغمورة فقط في المتوسط. إذا لزم الأمر، إضافة أو إزالة كميات صغيرة من المتوسط. وضع بعناية طبق بيتري في وسط حمام الزيت التحكم في درجة حرارته وتحقيق الاستقرار في طبق أفقيا عن طريق وضع ثلاث حلقات الفولاذ المقاوم للصدأ كبيرة (قطر 30 مم الخارجي، 4 مم في الطول و 1.5 ملم سمك الجدار) بجانب طبق في مجال النفط . تأكد من أن حلقات الصلب تلمس جوانب الطبق (الشكل 1-J). ببطء ماصة ما يقرب من 6 مل من الزيوت المعدنية الخفيفة على رأس المتوسطة مع ماصة نقل البلاستيك، بحيث يتم تغطية متوسطة مع طبقة مستمرة من الزيوت المعدنية (الشكل 1-K). إعداد اكتساب الوقت الفاصل. ملاحظة: التصوير الأجنة كما صور بانورامية أفقية من خمسة تداخل الصور الفرعية (البلاط) تتيح التصوير مفصل (الهدف 5X)، مع overvi العامةمصريات من التشكل 29-30. فترات التصوير ما بين 3 و 10 دقيقة تسمح لتتبع مفصل لالصرفية يغير 31، واكتساب صغيرة ض مداخن (5-7 طائرات مختلفة مع مسافة 30 ميكرون) تعوض عن الكثير من سماكة وتحول الجنين 30 . Z-الطائرات وفقا لأعلى النقيض من ذلك يمكن تحديد مزيد من المعالجة قبل 32 من الأطر واحد في الوقت الفاصل بين الأفلام (انظر القسم ممثل النتائج للحصول على معلومات مفصلة عن الحصول على الصور). الشكل 1: إعداد المغمورة ساندويتش مرشح ورقة. مشققة (A) بيضة في طبق بيتري. (ب) يتم إزالة معظم زلال سميكة ورقيقة من طبق بيتري مع ماصة نقل البلاستيك (لا يظهر). ثم، يتم إنشاء نافذة في زلال سميكةجولة الجنين عن طريق محو بلطف بعيدا زلال سميكة مع المناديل الورقية. يتم وضع (ج) ورقة الترشيح الناقل في جميع أنحاء الأريمة على الجزء العلوي من صفار البيض. يتم قطع (D) ورقة الناقل مرشح فضفاض من المحيط الغشاء المحي و (E) إزالتها من الجزء العلوي من صفار البيض. يتم غسلها (F) وصفار البيض المتبقية بعناية بعيدا في حمام-PC المالحة. وتقع (G) الجنين مع متطابقة الناقل ورق الترشيح الثاني. غارق (H) ورقة شطيرة مرشح على المديين المتوسط وضعه على حلقات الفولاذ المقاوم للصدأ اثنين من المعادن (جنين التي تواجه الظهرية أو الجانب البطني). (I) حلقتين استقرار شطيرة من أعلى. (J) وطبق بتري تحتوي على الجنين يتم نقلها إلى حمام الزيت التحكم في درجة حرارته. حلقات الفولاذ المقاوم للصدأ استقرار طبق بيتري أفقيا. وتغطي (K) ومستنبت مع طبقة من الزيوت المعدنية.(L) تخطيطي لشطيرة مرشح المغمورة. (M) أبعاد الناقلات ورق الترشيح المستخدمة في ورقة الترشيح شطيرة المغمورة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Representative Results

الشكل 2: مقارنة المورفولوجية بين الأجنة في المفوضية الأوروبية الثقافة (1) وفي الغارقة مرشح ورقة الثقافة ساندويتش. تظهر إطارات الوقت الفاصل بين اختيار الأجنة في 3 فترات ساعة. يتم تغيير حجم الإطارات لإعطاء لمحة عامة عن التشكل الجنين الكامل. تم الأجنة نفس العمر إلى مرحلة 7 الجسيدة (HH9) 15. تشير 0 ساعة بداية كل تجربة. الأمامي دائما إلى اليسار. تم الحصول على الصور باستخدام إضاءة الساحة المظلمة. (أ) الجنين في الثقافة الأوروبية 1، الجانب البطني مثقف حتى على-زلال آغار أسفل 1،33. صور عالية الجودة يمكن الحصول عليها، كما يقتصر الجنين في زي الاتجاه. (B و C) اثنين من الأجنة مثقف في ورقة الترشيح شطيرة المغمورة: (ب) الجانب بطني حتى و(C) ظهري حتى الجانب.أجنة في ورقة الترشيح شطيرة تتطور دون اختلافات نوعية بالنسبة لللا يقل عن 27 ساعة. يطورون الدورة الدموية وظيفية والثنية في الجمجمة وعنق الرحم وتحويل بنجاح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. يعتمد اكتساب الوقت الفاصل على النظام المجهر المتاحة. في هذه الدراسة، على مسافة العمل الطويلة، وكان يستخدم تستقيم المجهر التكبير. تم تعيين عامل التكبير إلى 5X. في تركيبة مع التكبير 16X العدسة، وهذا أدى إلى 80X مجموع التكبير، مع قرار النظري من 1.3 ميكرون / بكسل (كما ورد في البرنامج المجهر) 30. لزيادة مجال للرأي، تم تصوير الأجنة كما صور بانورامية أفقية من خمس صور الفرعية (البلاط). ولذلك، فإن المنطقة البلاط، ويتألف من خمسة البلاط متداخلة، تم تحديد 29. هذه المنطقة البلاطكان وضعه وذلك لتغطية كامل فتحة بيضاوية ورقة الناقل مرشح في الامتداد الأفقي لها (الشكل 2B – 0 ساعة). وكان كل البلاط من حجم 2048 س 2048 بكسل، والتي تغطي مجال الرؤية من حوالي 2.7 مم، وتم الحصول على البلاط مع تداخل من 10٪، مما أدى في المجموع مجال للرأي حوالي 12 مم × 2.7 مم لل بانوراما. انتقلت س ص-مرحلة الآلية بالنسبة إلى الهدف بسرعة ما يقرب من 1.75 ملم / ثانية بين الاستحواذ على البلاط منفصلة 29. وقد ركزت الصورة الحية على الأديم المتوسط ​​presomitic الأمامي وو somites الأكثر شكلت مؤخرا (والتركيز على البحوث مجموعتنا). للتعويض عن سماكة والشباك من الأجنة في زي الاتجاه، تم الحصول صغيرة ض مداخن (5-7 طائرات مختلفة مع مسافة 30 ميكرون) في كل نقطة زمنية 30. وقد تم اختيار هذه حول المستوى البؤري للطرف الأمامي من الأديم المتوسط ​​presomitic. مدة ACQ الوقت الفاصلتم تعيين uisition إلى 50 ساعة، وتم اختيار فترات التصوير من 3 أو 4 أو 10 دقيقة 31. ويمكن تحسين نوعية اكتساب الوقت الفاصل عن طريق تركيز كل 5-10 ساعة وإعادة تعريف كومة ض حول البؤري المثلى جديدة. في نهاية التجربة، تم تحرير كله السلاسل الزمنية يدويا، وتم إنشاء مجموعات فرعية من الصور التي تحتوي على ض الطائرة مع أفضل التركيز وحفظها إلى مجلد منفصل 32. وكانت هذه مجموعات فرعية من الصور مرة ومخيط لإنشاء كاملة الوقت سلسلة من الصور مع التركيز الأمثل. ومخيط البلاط من كل صورة من هذه كاملة السلاسل الزمنية وتنصهر معا دون تصحيح التظليل 30، والتي تم تصديرها لقطة مرور الزمن كما JPEG-صور 100٪ حجم و 95٪ ضغط 32. تم استيراد إطارات مرور الزمن كما تسلسل الصورة في البرامج المهنية تحرير الفيديو. استقرت مفصلة 100٪ الأزيز، وتم تعديل التباين العام تروق لنا. وكانت-إنقضاء زمن النهائية ترميزد مع الترميز H.264 وتصديرها في MPEG-4 حاويات. يتم عرض الأفلام في إطار معدل 15 لقطة / ثانية (الثانية) وقرار من 1920 س 1080 بكسل. ويبين الشكل 2 مقارنة بين الجنين في المفوضية الأوروبية الثقافة 1 (الشكل 2A) واثنين من الأجنة في تصفية الثقافة رقة شطيرة المغمورة، واحد يجري الجانب البطني مثقف يصل (الشكل 2B) وغيرهم من الجانب الظهري واحد حتى (الشكل 2C). وكانت جميع الأجنة إلى مرحلة الجسيدة سبعة (HH9) 15 وتصويرها مع القرار الزماني من 4 دقيقة (الشكل 2A وباء) أو 10 دقيقة (الشكل 2C) العمر المتطابقة. وصفت الإطارات المحددة من 3 فترات ساعة. سمحت الثقافة الأوروبية (الشكل 2A) التصوير مستقر للغاية نظرا إلى الجنين يستريح على مستقرة-زلال آغار أسفل 1،33. بقي الجنين كامل في طائرة واحدة محورية في جميع أنحاء رانه كله مرور الزمن. وهذا يمكن أن يكون مفيدا للتجارب أقصر (عدة ساعات) والأجنة في وقت مبكر جدا، ولكن لأنه يأتي مع الحبس قوية للجنين في زي الاتجاه، ربما تعوق نجاح تطورها ثلاثية الأبعاد على المدى الطويل. في البداية، أدى الحبس إلا في تسطيح الجانبي طفيف رأس الجنين مقارنة الجنين مثقف في المغمورة شطيرة ورق الترشيح مع جانبها بطني حتى (قارن الشكل 2A و 2B في 0 ساعة). وفي وقت لاحق، كان لديه عجز تحول الرأس (الشكل 2A – 21 ساعة) وضربات القلب تباطأ. الدورة الدموية توقف تقريبا. انظر التكميلي فيلم (1) لكامل الوقت الفاصل بين الجنين في الثقافة الأوروبية. تظهر لوحة العليا في هذا الفيلم لمحة كاملة عن الجنين، بينما يتصور لوحة على اليسار السفلي تطوير قلب الكاملة في القرار. تجزئة من الأديم المتوسط ​​presomitic إلى القطع البدنية النمطية يمكن أن يكون SEأون بالتفصيل في الجزء الأسفل من اليمين. أجنة في ورقة الترشيح شطيرة المغمورة، من ناحية أخرى، كانت محدودة في توسعها ثلاثي الأبعاد فقط من التوتر الطبيعي للأغشية المحيطة بهم. ويمكن أن يكون مثقف إما مع بطني بها (الشكل 2B) أو الجانب الظهري (الشكل 2C). وفي كلتا الحالتين، أظهرت الأجنة تكون الجسيدات مستمرة، وتحول رؤوسهم. أنها وضعت الثنية في الجمجمة وعنق الرحم وظيفي الدورة الدموية. تم تصوير كل من الأجنة في ورقة الترشيح شطيرة مع التركيز على الأديم المتوسط ​​بتجزئة، بحيث أجزاء من الرأس انتقلت تدريجيا من التركيز مع نمو الأجنة، سميكة، وبدأت تتحول، في حين بقي جزء بتجزئة من الأديم المتوسط ​​في التركيز (قارن الشكل 2B و2C في 21 ساعة إلى 27 ساعة). الفيلم التكميلي 2 يبين كامل فيلم الوقت الفاصل بين الجنين يصورفي الشكل 2B. كان الفاصل الزمني التصوير 4 دقائق. تظهر لوحة أعلى من هذا الفيلم لمحة كاملة عن الجنين. تم تصوير تطور الجنين على التوالي أكثر من 46 ساعة، ولكن بعد ما يقرب من 30 ساعة، والتركيز على الأديم المتوسط ​​بتجزئة ضاعت بسبب سماكة الشاملة وتحول من الأنسجة الجنينية. تظهر لوحة اليسرى السفلى والتنمية في وقت مبكر من القلب في حل كامل من إطارات الوقت الفاصل بين المكتسبة. من خلال انصهار براعم القلب تقرن على جانبي خط الوسط، ويتكون هيكل أنبوبي مباشرة تقريبا، والتي تبدأ في وقت لاحق الضرب والانحناء إلى اليمين. تظهر لوحة اليمنى السفلى أكثر القطع البدنية النمطية التي شكلت مؤخرا والطرف الأمامي من الأديم المتوسط ​​presomitic في كامل القرار والمسارات تشكيل القطع البدنية النمطية الجديدة مع مرور الوقت. الفيلم التكميلي 3 يظهر الجنين آخر مثقف وتصوير الجانب بطني حتى في ورقة الترشيح شطيرة المغمورة. كان الفاصل الزمني التصوير 4 دقائق. يغطي الفيلم الخامستنمية (ه) من الجنين من مرحلة HH5-6 إلى ما يقرب من يشنون HH14 15، على مدى ما يقرب من 27 ساعة من وقت الثقافة. أضعاف رأس أشكال وتقدم الخلف. الأشكال القلب من براعم الثنائي، يبدأ الضرب، والانحناءات إلى اليمين. تشكل 3-4 القطع البدنية النمطية الأولى في وقت واحد. برعم القطع البدنية النمطية إضافية خارج بالتسلسل من طرف الأمامي من الأديم المتوسط ​​presomitic. وتظهر اللوحة السفلى منطقة رأس الجنين في القرار الكامل، والسماح للمراقبة حظيرة رئيس وتشكيل القلب في وقت مبكر عالية من التفصيل. نظرا لشفافية للجنين، وإغلاق الأنبوب العصبي يمكن ملاحظتها في منطقة الرأس في المستقبل. الفيلم التكميلي 4 يعرض تشكيل الجسيدة في نفس الجنين في كامل القرار خلال وقت التصوير الكامل في اللوحة السفلى. الفيلم التكميلي 5 يبين كامل الوقت الفاصل بين الجنين ظهري مثقف حتى الجانب (الشكل 2C). كان الفاصل الزمني التصوير 10 دقيقة. في حين أن الاتحاد العقاريةإيه تظهر لوحة تطور الجنين من مرحلة الجسيدة سبعة (HH9) إلى ما يقرب من مرحلة HH16-17، يتم اقتصاص اللوحة السفلى لعرض التغييرات الشكلية في الدماغ في وقت مبكر في تلك المرحلة في كامل القرار. تورم محلي في الأنبوب العصبي يمكن ملاحظتها، مما أدى إلى أقلمة الدماغ الأمامي، الدماغ المتوسط، والمؤخر، والتي سوف تقسم إلى خمس مناطق دون إقليمية للدماغ الجنين في وقت لاحق من مراحل 13. وبالإضافة إلى ذلك، فإن نمو الحويصلات البصرية يمكن رؤيتها بوضوح. بعد ما يقرب من 30 ساعة في الثقافة، والجنين هو الموت. لإظهار التوافق بين مرشح ورقة شطيرة المغمورة مع التلاعب المجهرية، عدة ميكروبيدات البوليسترين (~ 40 ميكرون في القطر) تم زرعها في أو بالقرب من الأديم المتوسط ​​presomitic من جنين الدجاج في المرشح المغمور ثقافة رقة شطيرة. تم غسلها ميكروبيدات في برنامج تلفزيوني لإزالة العازلة التخزين وimplanتيد قبل تغطي مستنبت مع طبقة من الزيوت المعدنية الخفيفة (قارن إلى الخطوة 2.18 من قسم البروتوكول). تم استخدام الزجاج ماصة باستير لنقل الخرز على سطح الجنين، تحت الملاحظة من خلال العدسات المجهر. تم إنشاء خمسة ثقوب في الأديم الباطن عن طريق كشط بلطف مع إبرة الوخز بالإبر. وشكل J-أداة حسب الطلب، التي أنشأتها وتمتد الانحناء الزجاج ماصة باستير في لهب، وكان يستخدم لمعالجة الخرز ودفعهم بعناية في الثقوب حتى أصبحت قادرة على الحركة. وقد شغل ثلاثة ثقوب مع حبة واحدة كل (الشكل 3A – 0 ساعة و3B *) واثنين من الثقوب مع اثنين من الخرز كل (الشكل 3A – 0 ساعة). ويبين الشكل 3A، في أطر زمنية الفاصل المحدد، تطور الجنين الفرخ بعد زرع المجهرية من الخرز. أدرجت ثلاث حبات بنجاح في الأنسجة في الموقع المطلوب، وتصوير الحركة على مدىمسار التجربة بالتفصيل عالية (الشكل 3B). لا يبدو أن تطور الجنين قد انخفضت من التلاعب أو وجود من الخرز. انظر التكميلي الفيلم 6 لفيلم كامل الوقت الفاصل. كان الفاصل الزمني التصوير 4 دقائق. الشكل (3): الوقت الفاصل بين التصوير بعد ميكروبيدات زرع. إثبات صحة مبدأ التجربة تبين التوافق بين مرشح ورقة شطيرة المغمورة مع زرع ميكروبيدات. ورأس الجنين إلى اليسار، ولكن لم يكن تصوير ذلك خلال هذه التجربة. تم الحصول على الصور باستخدام إضاءة الساحة المظلمة. (A) مختارة الوقت الفاصل بين إطارات يظهر الجنين التلاعب في 3 فترات ساعة بعد غرس سبعة ميكروبيدات (~ 40 ميكرون في القطر). الجنين ممدود وبشكل مستمر تشكيل somit إضافيةوفاق. ويبدو أن ثلاث حبات قد تعلق وانتقل إعلامي مع تدفق من النسيج على مدار 18 ساعة من الثقافة بشكل صحيح. برزت أربعة حبات أخرى من جحورهم بين 6 و 9 ساعة من الثقافة وجنحت الخلف. (ب) عرض مفصل من الخرز ثلاثة واحدة (B1 إلى B3) زرعها في الأديم المتوسط presomitic في بداية التجربة (0 ساعة، B *) وبعد 12 ساعة من الحضانة (ب **). وأشار عدد من و somites تشكيل فقط (S9 في B * وS18 في B **). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. التكميلي الفيلم 1: EC-ثقافة بطني حتى الجانب. الجنين في الثقافة الأوروبية 1، الجانب البطني مثقف فوق، من مرحلة سبعة الجسيدة (HH9) 15 فصاعدا على بوتو أجار زلالم 1،33. كان الفاصل الزمني التصوير 4 دقائق. يتم عرض الوقت النسبي في الزاوية العلوية اليسرى. يمكن الحصول على الصور عالية الجودة، واقتصر على الجنين في زي الاتجاه. بعد 21 ساعة، ألقي القبض على ما يقرب من ضربات القلب وتدفق الدم وكان الجنين بدأ في التفكك. تظهر لوحة العليا لمحة تغيير حجمها من الجنين، بينما تصور لوحات أقل تطوير قلب (اللوحة اليسرى) وتجزئة من الأديم المتوسط ​​presomitic (اللوحة اليمنى) في كامل القرار (100٪ التكبير). (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). الفيلم التكميلي 2: تصفية المغمورة ساندويتش ورقة بطني حتى الجانب. جنين مثقف في ورقة ساندويتش المغمورة من مرحلة سبعة الجسيدة (HH9) 15 فصاعدا، سيد بطنيالبريد مواجهة. كان الفاصل الزمني التصوير 4 دقائق. يتم عرض الوقت النسبي في الزاوية العلوية اليسرى في ساعة ودقيقة، إعادة تشغيل بعد 24 ساعة. تظهر لوحة العليا لمحة تغيير حجمها من تطور الجنين أكثر من 46 ساعة، على التوالي. يتصور لوحة اليسرى السفلى تطوير القلب في وقت مبكر خلال ساعة 10 الأولى من الحصول على الصور الكاملة في القرار (100٪ التكبير). لوحة اليمنى السفلى يصور بتجزئة الأديم المتوسط ​​على مدى ما يقرب من 30 ساعة من التنمية في كامل القرار (100٪ التكبير) حتى يتم فقدان التركيز بسبب سماكة الشاملة وتحول من الأنسجة الجنينية. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). الفيلم التكميلي 3: رئيس طية تشكيل. جنين مثقف الجانب بطني حتى في المغمورة شطيرة ورق الترشيح من انهإعلان عملية / المرحلة رئيس أضعاف (HH5-6) 15 إلى ما يقرب من المرحلة 22 الجسيدة (HH14) 15 على مدى ما يقرب من 27 ساعة من وقت الثقافة. كان الفاصل الزمني التصوير 4 دقائق. يتم عرض الوقت النسبي في الزاوية العلوية اليسرى في ساعة ودقيقة، إعادة تشغيل بعد 24 ساعة. تظهر لوحة العليا لمحة تغيير حجمها لتطور الجنين. اللوحة السفلى يصور منطقة رأس الجنين في كامل القرار (100٪ التكبير). تشكيل أضعاف الرأس والقلب المبكر وإغلاق الأنبوب العصبي ويمكن ملاحظة. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). الفيلم التكميلي 4: تكون الجسيدات. جنين مثقف الجانب بطني حتى في المغمورة شطيرة ورق الترشيح من الرأس عملية / رأس أضعاف مرحلة (HH5-6) 15إلى ما يقرب من المرحلة 22 الجسيدة (HH14) 15 على مدى ما يقرب من 27 ساعة من وقت الثقافة. كان الفاصل الزمني التصوير 4 دقائق. يتم عرض الوقت النسبي في الزاوية العلوية اليسرى في ساعة ودقيقة، إعادة تشغيل بعد 24 ساعة. تظهر لوحة العليا لمحة تغيير حجمها لتطور الجنين. اللوحة السفلى يصور الأديم المتوسط ​​المجاور للمحور بتجزئة الكاملة في القرار (100٪ التكبير). (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). الفيلم التكميلي 5: تصفية المغمورة ساندويتش ورقة الجانب الظهري. جنين ظهري مثقف الجانب حتى في المغمورة شطيرة ورق الترشيح من مرحلة الجسيدة سبعة (HH9) 15 تقريبا إلى مرحلة HH16-17 15. كان الفاصل الزمني التصوير 10 دقيقة. يتم عرض الوقت نسبيفي الزاوية العلوية اليسرى في ساعة ودقيقة، إعادة تشغيل بعد 24 ساعة. تظهر لوحة العليا لمحة تغيير حجمها لتطور الجنين. اللوحة السفلى يصور التغيرات الشكلية في الدماغ في وقت مبكر في كامل القرار (100٪ التكبير). توفي الجنين بعد حوالي 30 ساعة في الثقافة. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). الفيلم التكميلي 6: ميكروبيدات المزروعة. جنين الجانب البطني مثقف حتى في شطيرة ورق الترشيح المغمورة لحوالي 19 ساعة، بدءا من مرحلة الجسيدة تسعة (HH9-10) 15. كان الفاصل الزمني التصوير 4 دقائق. يتم عرض الوقت النسبي في الزاوية العلوية اليسرى في ساعة ودقيقة. تظهر لوحة العليا لمحة تغيير حجمها في المنطقة الذيل مع سبعة ميكروبيدات مزروع في العلاقات العامةالأديم المتوسط ​​esomitic. وتظهر اللوحة السفلى المنطقة مع ميكروبيدات مزروع في كامل القرار (100٪ التكبير). (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

Discussion

كما متغير جديد من الثقافة الأوروبية راسخة 1، والمغمورة ورقة مرشح شطيرة يسهل الاستيلاء على المدى الطويل brightfield والساحة المظلمة الوقت الفاصل بين الأفلام من أوائل السابقين كتكوت الجنين البيضة بجعل و للحرارة الرطوبة التي تسيطر عليها حاضنة حول المجهر الاستغناء عنها. بدلا من أن تكون تربيتها على شبه صلبة أسفل أجار زلال، يتم الاحتفاظ المغمورة الأجنة تماما في مستنبت بسيطة تتكون من PC-المالحة وزلال رقيقة. يتم الحد من التبخر وفقدان الحرارة عن طريق طبقة من الزيوت المعدنية تطفو على أعلى من المتوسط ​​الثقافة. الأجنة يمكن تربيتها بسهولة، إما الظهرية أو بطني حتى الجانب، دون اختلافات واضحة في الجودة. كما هو موضح هنا والأجنة في ورق الترشيح شطيرة المغمورة متاحة للتدخلات المجهرية، مثل تطبيق حبات غارقة محدثة التخلق. وتشمل التطبيقات المستقبلية مضان يعيش التصوير، إبر دقيقة جدا و electroporation، والجينات إسكات إلى manipulate ودراسة مجموعة واسعة من الأحداث تخلقية خلال بطني تنمية (على سبيل المثال، والقلب في وقت مبكر وتكون الجسيدات) والظهرية (على سبيل المثال، في وقت متأخر تكون المعيدة، وإغلاق الأنبوب العصبي، والدماغ المبكر). علاج المخدرات تعتمد على الوقت مجدية إذا تم استبدال طبق بتري تحتوي على ورقة الترشيح شطيرة مع غرفة التروية، والسماح للتبادل مستنبت تحت طبقة الزيوت المعدنية. سوف المغمورة ورقة فلتر شطيرة تطوير إمكاناتها التصوير الكاملة في تركيبة مع التصوير القائم على الليزر (بما في ذلك الفحص المجهري ورقة ضوء) والأهداف الغمر.

وسيتم تناول بعض الصعوبات مع إعداد ورقة فلتر شطيرة غارقة في الفقرات التالية. على الرغم من أنه لا يتطلب سوى كمية معتدلة من التدريب لنقل الجنين من صفار البيض في ورقة ساندويتش التصفية، يمكن أن العديد من الخطوات لا تزال تؤثر بشكل كبير على نوعية الجنين في الثقافة. قبل الناقل ورقة المرشح هووضعت على صفار البيض، والغشاء المحي حول الجنين يجب الافراج عن أي زلال سميكة. عندها فقط سوف اتصال بين ورقة الترشيح والغشاء المحي تكون قوية بما يكفي لتحمل الغسيل في PC-المالحة. ورقة الترشيح التي تحمل الجنين يجب عبور اجهة / الهواء السائل أقل قدر ممكن للحد من التوتر على الأغشية. مرة واحدة جلبت إلى PC-المالحة للغسيل، مرشح كله رقة الناقل يجب أن تبقى مغمورة تماما في جميع الأوقات. الوقت في الحمام-PC المالحة يجب أن يقتصر على حوالي 30 – 60 ثانية، والغشاء المحي وسوف تبدأ الإفراج عن من ورقة الترشيح. ومع ذلك، فإن تنظيف الجنين يجب أن يتم تنفيذها بدقة جدا، وبقايا صفار وفي وقت لاحق تحجب ضوء الجنين. أثناء الغسل، لم توجه تيار من ماصة نقل مباشرة على الجنين، ولكن دائما شعاعيا بعيدا عن ذلك. بعد إزالة الجنين من PC-المالحة، تأكد من مسك ورقة الترشيح أفقيا للحد منالتوتر على الأغشية الجنينية. ثم، وتثبيت الجنين مع ثاني حاملة ورق الترشيح. مرة واحدة يتم وضع الثاني الناقل رقة الترشيح، وتجنب خلق أي توتر الجانبي، والتي يمكن أن تحول شركات الطيران ورق الترشيح بالنسبة لبعضها البعض وتمزق الأغشية الجنينية. عندما يتم جلب شطيرة ورق الترشيح في مستنبت، فإنه ينبغي أيضا عبر واجهة الهواء / السائل مرة واحدة فقط للحد من التوتر على الأغشية. يجب وضع الزوج الثاني من حلقات الفولاذ المقاوم للصدأ المستخدمة لتحقيق الاستقرار في شطيرة ورق الترشيح من أعلى ببطء شديد ودون أي ضغط لتقليل ضغط من الأغشية الجنينية. تمزقات صغيرة من المعتمة مجال الجنين عادة ما تلتئم خلال الساعة الأولى من الثقافة، ولكن يمكن ويجب أن يتم استبدال الجنين بأضرار دائما عينة جديدة قبل pipetted طبقة الزيت على أعلى مستنبت.

لصورة الجنين بأكمله أو عينات متعددة عالية الدقة الوقت الفاصل بين الأفلام، وهيئة التصنيع العسكرييجب أن تكون مجهزة roscope مع س ص-مرحلة الآلية، التي تسيطر عليها البرنامج المجهر. ومن الأهمية الحاسمة لهذه الخطوة س ص المرحلة مع سرعة الحد الأدنى لتجنب الأضرار التي لحقت الأجنة والاضطرابات في مستنبت والنفط، والتي سوف تقلل من جودة الصورة. لاكتساب الوقت الفاصل بين الأفلام المعروضة هنا، انتقلت س ص-مرحلة الآلية مع سرعة ما يقرب من 1.75 ملم / ثانية. في المستقبل، والتصوير يمكن زيادة تحسين طريق نقل أول مرحلة إلى الموضع المطلوب والحصول على صورة بعد فترة راحة قصيرة للسماح الاهتزازات والاضطرابات تتلاشى.

الحصر، يجب أن يكون المستخدمين المحتملين على بينة من مسافة طويلة نسبيا العمل (حوالي 1 سم) اللازمة لهذا الأسلوب الثقافة إذا تم استخدام المجهر تستقيم بدون أهداف الغمر. هذا العمل لمسافات النتائج من الطبقة المتوسطة ومن الزيوت المعدنية على رأس الجنين. في 6 سم طبق بتري، وطبقة النفط لديها thicknesوغمرت المياه 1.5 ملم، والجنين حوالي 4 مم عميقة في مستنبت – الصورة من حوالي 1. اعتمادا على قطر الهدف، الحافة العلوية للطبق بيتري 6 سم ويمكن أيضا أن يحد من الوصول إلى الجنين. يمكن التحايل عليها هذه باستخدام طبق أكبر.

المسافة العمل من أعلى يمكن أن تخفض قليلا عن طريق التقليل من سمك الطبقات السائلة. وبالإضافة إلى ذلك، وبعد العمل من دون أن يكون الحد الأدنى من خلال جلب الجنين نزولا إلى أسفل طبق بتري وتقليل سمك زجاج النافذة من الكأس ساخنة. بينما الأمثل بروتوكول للعمل مع العمل لمسافات طويلة التكبير المجهر تستقيم، يمكن تركيبها على مجهر مقلوب أيضا. يجب على المستخدمين في المستقبل أن نضع في اعتبارنا أن تغمر الجنين عميقا جدا في مستنبت قد يؤدي إلى O 2 -diffusion مشاكل، على الرغم من أن التجارب الأولية تشير إلى أن انتشار محدود لا يبدو أن هناك مشكلهليم، طالما وتحيط الجنين عن طريق خزان بما فيه الكفاية واسع من الثقافة والمتوسطة ورقة الترشيح ورطة غير الضغط على الجزء السفلي من طبق بيتري.

الحد الآخر هو التحكم في درجة الحرارة. عن طريق ضبط درجة الحرارة وحدة تحكم عن الكأس تسخينها إلى 40 درجة مئوية، ودرجة الحرارة في المتوسط ​​equilibrates إلى 37.5 درجة مئوية في جميع أنحاء الأجنة عندما يتم تغطية متوسطة مع الزيوت المعدنية. هذا يدل على أن بعض الطاقة المفقودة بين الجزء السفلي من الكأس، حيث توجد عناصر التدفئة واستشعار درجة الحرارة، وموقع الأجنة. يمكن أن يكون الأمثل التحكم في درجة الحرارة عن طريق نقل وأجهزة الاستشعار وإعادة توزيع عناصر التدفئة.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

المؤلفون تقر دعما ماليا من منحة ZonMW-فيشي 918.11.635 (هولندا). فإن الكتاب أود أن أشكر متجر أداة من جامعة فريجي في أمستردام لاقتراحات عملية ولتصنيع مكونات برنامج الإعداد ويارنو Voortman من كارل زايس هولندا للحصول على المشورة المفيدة حول المجهري. كان ماريولين Blaauboer دعما كبيرا في تعليقه حاسم على عدة مسودات للمخطوطة.

Materials

Milli-Q Reference Water Purification System Millipore Z00QSV0WW 
Duran laboratory bottles, with caps, 1L Sigma-Aldrich/Duran Z305200-10EA 
Name Company Catalog Number Comments
Solution A
NaCl Merck Millipore 1064041000
KCl Merck Millipore 1049361000
CaCl2 H2O Merck Millipore 1023821000
MgCl2.6H2O Merck/Sigma-Aldrich 13152-1KG-D 
Name Company Catalog Number Comments
Solution B
Na2HPO4.2H2O Merck 1065801000
NaH2PO4.2H2O Merck 1063420250
Name Company Catalog Number Comments
Whatman qualitative filter paper, Grade 595 Sigma-Aldrich 10311611
Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130W, wavelength 10.6 µm Micro Lasersystems
Tork Extra Soft Facial Tissues Tork 140280
Latex gloves Sigma-Aldrich Z645613
EMDAMED EMDA 300.131
Transfer pipettes Sigma-Aldrich Z350613
VWR WITG5.480.003
accu-jet pro Pipette Controller BrandTech Scientific 26332
Serological plastic pipettes, 25mL Sigma-Aldrich CLS4251
Plastic document sleeves
Egg incubator – Incubator mod. Cip Cip 40 Fiem
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) Drost BV (Loosdrecht, NL)
10 cm Tissue culture dishes Sigma-Aldrich P5731
Greiner Bio-one 664160
6 cm Petri dishes Sigma-Aldrich P5481
50ml Centrifuge tubes , Greiner centrifuge tubes  or Cellstar tubes Sigma-Aldrich T2318
greiner bio-one 227261
Name Company Catalog Number Comments
Stainless steel rings, custom-made
Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness
Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring
Nail scissors
Forceps, Dumont #5, Inox Fine Science Tools , F.S.T. 11251-20
Fine, really sharp scissors for cutting filter paper VWR 21-102
M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil Sigma-Aldrich CAS Number 8042-47-5
Name Company Catalog Number Comments
Agar bottoms for EC culture
Agarose Sigma-Aldrich A9539 SIGMA
NaCl Sigma-Aldrich S7653 SIGMA-ALDRICH
Name Company Catalog Number Comments
Microbead implantation
Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) Polysciences, Inc. 16905-1
Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30mm SEIRIN  type J, No.02, 0.12x30mm
PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023 
Name Company Catalog Number Comments
Temperature controlled beaker
RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M Omega RTD-850M
Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M Omega HSRTD-3-100-A-1M
Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 Omega EXTT-3CU-26S-50
3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M Omega MTP-U-M
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P Omega KHLV-103/(10)-P
Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC Omega CNi16D24-C4EIT-DC
Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)
Name Company Catalog Number Comments
Microscope setup
Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN Carl Zeiss AG 495010-0009-000
Objective PlanNeoFluar Z 1.0x/0.25 FWD 56mm Carl Zeiss AG 435281-9100-000
Manual Rotary Control MARC Carl Zeiss AG 435604-0000-000
Transillumination top 450 mot Carl Zeiss AG 435500-9000-000
Motorized measuring stage S 150×100 mot; CAN (D) Carl Zeiss AG 435465-9020-000
Insert plate S, glass 237x157x3mm (D) Carl Zeiss AG 435465-9053-000
Controller EMS 3 Carl Zeiss AG 435610-9010-000
System Control Panel SYCOP 3 Carl Zeiss AG 435611-9010-000
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera Hamamatsu C11440-22CU
Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual Carl Zeiss AG 490004-0025-000
Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US Carl Zeiss AG 410373-0200-000
LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" Carl Zeiss AG 410350-2403-000 not available anymore
ZEN pro 2012 Hardware License key Carl Zeiss AG 410135-1002-120 not available anymore
ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key Carl Zeiss AG 410136-1045-110
ZEN module Z Stack Carl Zeiss AG 410136-0030-110
ZEN Module Tiles/ Positions Carl Zeiss AG 410136-1025-110
ZEN Module Time Lapse Carl Zeiss AG 410136-1031-110
ZEN Module Experiment Designer Carl Zeiss AG 410136-1022-110
ZEN Desk 2012 Hardware License Key Carl Zeiss AG 410135-1004-120 not available anymore
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Dev. Dyn. 220 (3), 284-289 (2001).
  2. Rozbicki, E., et al. Myosin-II-mediated cell shape changes and cell intercalation contribute to primitive streak formation. Nat. Cell Biol. 17 (4), 397-408 (2015).
  3. Smith, J. L., Schoenwolf, G. C. Neurulation: Coming to closure. Trends Neurosci. 20 (97), 510-517 (1997).
  4. Schoenwolf, G. C., Sheard, P. Shaping and bending of the avian neural plate as analysed with a fluorescent-histochemical marker. Development. 105 (1), 17-25 (1989).
  5. Colas, J. F., Schoenwolf, G. C. Towards a cellular and molecular understanding of neurulation. Dev. Dyn. 221 (2), 117-145 (2001).
  6. Pourquié, O. The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies. Mech. Dev. 121 (9), 1069-1079 (2004).
  7. Maenner, J. Cardiac looping in the chick embryo: A morphological review with special reference to terminological and biomechanical aspects of the looping process. Anat. Rec. 259 (3), 248-262 (2000).
  8. Wittig, J. G., Münsterberg, A. The Early Stages of Heart Development Insights from Chicken Embryos. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 3 (2), (2016).
  9. Layer, P. G., Alber, R. Patterning of chick brain vesicles as revealed by peanut agglutinin and cholinesterases. Development. 109 (3), 613-624 (1990).
  10. Nakamura, H., Nakano, K. E., Igawa, H. H., Takagi, S., Fujisawa, H. Plasticity and rigidity of differentiation of brain vesicles studied in quail-chick chimeras. Cell Differ. 19 (3), 187-193 (1986).
  11. Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. Fate map of the chick embryo neural tube. Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).
  12. Andermatt, I., Stoeckli, E. T. RNAi-based gene silencing in chicken brain development. Methods Mol. Biol. 1082, 253-266 (2014).
  13. Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).
  14. Endo, Y. Chick embryo culture and electroporation. Curr. Protoc. Cell Biol. , Unit 19.15 (2012).
  15. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
  16. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In Ovo Live Imaging of Avian Embryos. Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (6), (2010).
  17. Borwompinyo, S., Brake, J., Mozdziak, P. E., Petitte, J. N. Culture of chicken embryos in surrogate eggshells. Poult Sci. 84 (9), 1477-1482 (2005).
  18. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. J. Vis. Exp. (44), e2154 (2010).
  19. Auerbach, R., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41 (2), 391-394 (1974).
  20. New, D. A. T. A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morphol. 3 (4), 320-331 (1955).
  21. Stern, C. D., Bachvarova, R. Early chick embryos in vitro. Int. J. Dev. Biol. 41 (2), 379-387 (1997).
  22. Nagai, H., Lin, M. C., Sheng, G. A modified cornish pasty method for ex ovo culture of the chick embryo. Genesis. 49 (1), 46-52 (2011).
  23. Connolly, D., McNaugbton, L. A., Krumlauf, R., Cooke, J. Improved in vitro development of the chick embryo using roller-tube culture. Trends Genet. 11 (7), 259-260 (1995).
  24. Rupp, P. A., Rongish, B. J., Czirok, A., Little, C. D. Culturing of avian embryos for time-lapse imaging. Biotechniques. 34 (2), 274-278 (2003).
  25. Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS One. 4 (10), e7429 (2009).
  26. Nagai, H., Sezaki, M., Nakamura, H., Sheng, G. Extending the limits of avian embryo culture with the modified Cornish pasty and whole-embryo transplantation methods. Methods. 66 (3), 441-446 (2014).
  27. Pannett, C., Compton, A. The Cultivation of Tissues in Saline Embryonic Juice. Lancet. 203 (5243), 381-384 (1924).
  28. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3 (3), 419-426 (2008).
  29. . GmbH ZEN 2 – (blue edition) – Software Guide Available from: https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf (2014)
  30. Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. Culture of Avian Embryos. Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).

Tags

Chick EmbryosEx Ovo CultureTime-lapse ImagingNeurulationGastrulationSomitogenesisPannett-Compton SalineAlbumenFilter Paper CarrierVitelline MembraneYolk

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (118), e54636, doi:10.3791/54636 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image