의 유전자형<em> 황색 포도상 구균</em>에 의해 리보솜 스페이서 PCR (RS-PCR)
Summary
Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.
Abstract
The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.
Introduction
황색 포도상 구균 (S. 구균) 소 1 유방 내 감염 (IMI)에 대한 전 세계적 책임을 가장 중요한 병원체로 알려져있다. 12 유럽 국가 그 소에 Cosandey 등. 3, 보스 등. (4)에 의해 푸르니에 등. 2 스위스 암소에서 설명하고 연구의 연구 S. 구균은 IMI는 유 전적으로 이질적인 그룹 소에서입니다. 16S-23S rRNA의 유전자 간 스페이서 영역 (RS-PCR)의 PCR 증폭에 의해, 17 유전자형 총 초기 101 역학적 분리 독립이 검출되었다. 다른 15 유전자형 GTS (가) 각 1 모든 균주의 % 4을 거의 발생하지 반면 유전자형 B 및 유전자형 C (GTC)는 (80 %) 가장 많았다. 유럽 레벨 3에서 GTB는 GTC는 GTF, GTI, 그리고 GTR은 분석 된 모든 균주 (N = 456)의 76 %를 포함하는 가장 중요한 유전자형이었다. GTB는 w 중부 유럽에 위치하고했다hereas 다른 유전자형 널리 전파되었다. 균주의 나머지 24 %는 그들 중 많은,하지만, 한 번만 관찰되었다 (41) 유전자형을 포함.
유전자형이 높은 유럽 수준으로 스위스에서뿐만 아니라, 그들의 독성 유전자 패턴과 연관되었는지 포니 외. 2 Cosandey 외. (3), Graber 외. (5)에 의한 연구는 또한 보여 주었다. 연구는 또한 S. 중 IMI 보급에 엄청난 차이를 밝혀 구균 GTB, GTC 다른 유전자형 2,5 : GTB 고려, 무리 암소의 87 %까지이 유전자형에 감염되었다. GTC의 다른 유전자형의 경우에, 그러나, IMI은 무리 1-2 소에서 발견되었다.
IMI S.에 의해 발생 구균은 일반적으로 해당 유방 동맥의 염증과 우유에서 염증 세포의 증가를 초래한다. 결과적으로, 체세포 CO우유에 unts (SCC), 대부분의 국가에서 우유 품질의 주요 지표는 감소 우유 가격 또는 납품 정지로 이어지는 증가한다.
포니 외. (2)의 RS-PCR 외에, 다른 입력 방법은 S.의 소 하위 유형 균주에 대해 기재 한 구균 8-11. 두 가지 일반적인 것들로는 스파 입력 (12)과 멀티 자취 그리기 순서 타이핑 (MLST) (13)를 포함한다. 후자 7 하우스 키핑 유전자의 염기 서열을 필요로하는 반면, 전 하나, 단백질 A에 대한 포도상 구균 스파 코딩하는 유전자의 가변 영역을 스페이서 DNA 시퀀싱에 기초한다. 이것은 하나의 12 일곱 PCR들 (13) 각각의 특정 장치를 사용하여 앰플 리콘 정화 시퀀싱 반응을 분석 한 후, 수행 될 필요가 있음을 의미한다. RS-PCR에 비해, 이러한 방법은 낮은 샘플 처리량과 높은 비용의 결과로 실험실에서 상당한 추가적인 노력이 필요합니다. 그만큼처리량은 PFGE 특히 낮습니다. S.의 소 균주에 대한 이러한 방법의 해상도를 고려 구균, RS-PCR 적어도 MLST 4 PFGE (15)보다 4 더 나은를 입력 스파만큼 좋은 것입니다.
바이너리 입력 (13)을 포함한 모든 이들 방법은 S.으로 인한 소 IMI의 발병에 더 통찰력을 얻기에 그 효과를 입증 구균,하지만 때문에 언급 제한으로 그들은 많은 임상 연구 덜 적합하다. 또한, RS-PCR에 의한 유전자형 포니 등에 의해 설명 된 바와 같이. 2 역학적 S.의 발병 가능성을 예측 신뢰성있게 구균, 소 IMI 임상 수의학에 두 개의 키 값을 포함했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
RS-PCR (> 30 순수한 DNA / 분석 겨)에서 DNA의 초과가있을 때 전체 공정의 가장 중요한 단계는이. 그 피크가 모두 기준선에서 시작 및 종료하는 경우 일반적으로, 프로파일의 해상도가 최적이다. 두 개의 피크가 서로 너무 가까이있는 경우, 해상도는 완전하지 않습니다. 수동 식별을 필요되도록 이러한 조건 bioanalyzer 소프트웨어 부적절한 피크 식별을 초래할 수있다.
BP ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks R. Boss, A. Cosandey, C. Fournier, I. Ivanovic, and J. Naskova for their excellent work.
Materials
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Merck | 1.08382.0500 | Mw =121.14g/mol |
| Titriplex III | Merck | 1.08418.0250 | Mw = 372.24g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O |
| Hydrochloric acid 5mol/l | Merck | 1.09911.0001 | |
| Columbia agar+5% sheep blood | bioMérieux | 43049 | |
| Agilent DNA7500 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Agilent 2100 expert sofware | Agilent Technologies | ||
| HotStarTaq master mix | Qiagen | 203445 | |
| Primer L1 | Mycrosinth | 5'CAA GGC ATC CAC CGT3' | |
| Primer G1 | Mycrosinth | 5'GAA GTC GTA ACA AGG3' |
References
- Sears, P. M., McCarthy, K. K. Management and treatment of staphylococcal mastitis. Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract. 19 (1), 171-185 (2003).
- Fournier, C., et al. Bovine Staphylococcus aureus: association of virulence genes, genotypes and clinical outcome. Res.Vet.Sci. 85 (3), 439-448 (2008).
- Cosandey, A., et al. Staphylococcus aureus genotype B and other genotypes isolated from cow milk in European countries. J.Dairy Sci. 99 (1), 529-540 (2016).
- Boss, R., et al. Bovine Staphylococcus aureus: Subtyping, evolution, and zoonotic transfer. J.Dairy Sci. 99 (1), 515-528 (2016).
- Graber, H. U., et al. Mastitis-related subtypes of bovine Staphylococcus aureus are characterized by different clinical properties. J.Dairy Sci. 92 (4), 1442-1451 (2009).
- Heiniger, D., et al. Kosten-Nutzen-Analyse einer Intervention zur Verbesserung der Eutergesundheit in Schweizer Milchviehbetrieben. Schweiz.Arch.Tierheilkd. 156 (10), 473-481 (2014).
- Hamann, J. Definition of the physiological cell count threshold based on changes in milk composition. IDF Mastitis Newsletter. 25, 9-12 (2003).
- Hwang, S. Y., Park, Y. K., Koo, H. C., Park, Y. H. spa typing and enterotoxin gene profile of Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk in Korea. J.Vet.Sci. 11 (2), 125-131 (2010).
- Sakwinska, O., et al. Link between genotype and antimicrobial resistance in bovine mastitis-related Staphylococcus aureus strains, determined by comparing Swiss and French isolates from the Rhone Valley. Appl.Environ.Microbiol. 77 (10), 3428-3432 (2011).
- Rabello, R. F., et al. Multilocus sequence typing of Staphylococcus aureus isolates recovered from cows with mastitis in Brazilian dairy herds. J.Med.Microbiol. 56, 1505-1511 (2007).
- Tavakol, M., et al. Bovine-associated MRSA ST398 in the Netherlands. Acta Vet.Scand. 54, 28 (2012).
- Harmsen, D., et al. Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management. J.Clin.Microbiol. 41 (12), 5442-5448 (2003).
- Zadoks, R., et al. Application of pulsed-field gel electrophoresis and binary typing as tools in veterinary clinical microbiology and molecular epidemiologic analysis of bovine and human Staphylococcus aureus isolates. J.Clin.Microbiol. 38 (5), 1931-1939 (2000).
- Cremonesi, P., et al. Genomic characteristics of Staphylococcus aureus strains associated with high within-herd prevalence of intramammary infections in dairy cows. J.Dairy Sci. 98 (10), 6828-6838 (2015).
- Enright, M. C., Day, N. P., Davies, C. E., Peacock, S. J., Spratt, B. G. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J.Clin.Microbiol. 38 (3), 1008-1015 (2000).
