ile Enfeksiyon sırasında boşaltılması Lenf düğümleri içine Fare Cilt Dendritik Hücre Göç Eğitim Bir KAKE tabanlı Testi<em> Mycobacterium bovis</em> Basil Calmette-Guerin
Summary
An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Guérin.
Abstract
Dendritik hücreler (DC) lenf düğümü (DLN) kendi elde yeteneği ve mekik antijen ile kısmen, bağışıklık karşılıklarının başlatılması için önemlidir. DLN için DC'lerin seferberlik karmaşıktır ve tam olarak enfeksiyon sırasında tam olarak açıklığa kavuşmuş. Burada C57BL Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin (BCG) ile ayak tabanı enfeksiyonu sırasında DClerin taşıma izlemek için florokrom 5- ve 6-karboksiflüoresein diasetat süksinimidil ester (CFSE) dayanan bir yenilikçi basit bir deney kullanılması da tarif / 6 fareleri. Bu tahlil aktif BCG cevaben drenaj popliteal LN taşınmaya cilt DC alt popülasyonlarının karakterizasyonu sağlar. Bu protokol göçmen cilt DH'ler flow sitometri ile tespit edilmiştir BCG modelinden kaynaklanmaktadır. Tahlil DC'lerin veya diğer hücrelerin çalışma ve tanımlama sevimli olduğunu eve Popliteal LN mikropların, metabolitleri veya enflamatuar diğer aşılama sonrasıBu hücrelerin göçünü düzenleyen faktörleri incelemek için sonuç Kapkaççı uyaranlara ve.
Introduction
Vücut yüzeylerinde lokalize DCler mikrop ya da ürünlerini duygusu, ve bunu yaparken tahliye LN (DLN) 1,2 lenf damarları yoluyla harekete. Bu yer değiştirme DLN istilacı mikrop karşı immun yanıtların sonucu prime mikrobiyal antijen taşınması için gereklidir. DLN T-hücre yanıtı 3-5 kısar için Nitekim, DC'lerin blokajı veya başarısızlık enfekte doku göç. Bu duruma göre, tek hücre düzeyinde taşıma izlemek için tasarlanmış tahliller, belirli bir DC alt kümesine atfeden göç yardım fonksiyonu yararlıdır.
DLN cilt DC'lere seferber verilerin büyük bir gövde var. Iltihaplı veya enfekte sitelerden 2 DC göç konusunda bilgi çok ikincisi hesaplar. Cilt DC'lere büyük bir nüfusa ev sahipliği ve laboratuvar fare deney için son derece erişilebilir yüzey olduğundan bu şaşırtıcı değildir. Çeşitli teknikler bu şekilde değerlendirilmesi için geliştirilmiştirDLN 2 ciltten fare DC'lerin göç. FITC deri boyama arayla en yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım gereğidir. Bu deneyde, florokrom fluoresein-5-izotiyosiyanat (FITC), aseton ve bir temas tahriş ile bir karışım hazırlanmıştır. Bu kokteyl tüy dökücü krem uygulanmış ve traş edilmiş derisine uygulanmış ve FITC-işaretli hücrelerin birikimi DLN analiz da bulunmaktadır. Göç aynı zamanda ciltteki floresan parçacıkları içselleştirmiş fagositik hücrelerin takibini sağlayan florokrom etiketli nano veya mikro, cildi enjekte edilerek ele alınabilir. Lenf damarları da doğrudan lenf göç DC'leri ayıklamak için kanüle edilebilir. Bu, özellikle farelerde, ancak teknik olarak zordur. sonraki analiz için elde edilen DC'lerin aynı zamanda belirli bir sınırlayıcı faktördür.
Cilt DC göç konusunda birçok önceki çalışmalarda rağmen, DLN aşağıdaki vacci cilt DC seferberlik ile ilgili bir bilgi yetersizlik kalırBacille Calmette-Guerin (BCG), Mycobacterium bovis canlı, zayıflatılmış suş ile Ulus M. karsı ası olarak kullanılabilen tüberküloz. BCG bir T yardımcı hücre tipi 1 tepkisi tetikler sınırlı enfeksiyona neden deride aşılanır. Hem bu süreçte onların göç düzenleyen BCG ile enfekte cilt DLN için harekete DC alt popülasyonları ve faktörler tam olarak anlaşılmış değildir. Florokrom 5- ve 6-karboksiflüoresein diasetat süksinimidil ester (CFSE) DLN 3'e DClerin taşıma izlemek için yerinde enjekte edilen, yukarıdaki bilgiler ışığında, basit ama yeni bir yöntem geliştirilmiştir. C57BL / 6 fareleri, BCG bir aşı ve kurban etmeden önce gün arka ayak yastığından enjekte edilir, hayvanlar CFSE yüksek konsantrasyonlu ile aynı şekilde enjekte edilir. Yirmidört saat sonra hayvanlar öldürülür ve boşaltma popliteal ln (PLN) çıkarıldı ve akış sitometrisi için hazırlanır. Bu deney, ide sağlarDLN için ayak tabanı deriden gece boyunca göç hücreleri (Şekil 1) ntification.
Ayrıca, gen hedefli fareler DLN için harekete geçirmek hücreler için gerekli olan faktörleri belirlemek yardımcı olmak için kullanılabilir. Bu testi kullanılarak, bu raporun yazarları, daha önce bulduk İnterlökin-1 reseptör ve hücre içi adaptörü molekül MyD88 3 tarafından düzenlenen bir süreçte DLN için EpCAM düşük CD11b yüksek göç cilt DC'ler taşıma BCG. Akış sitometri göç deri DC'ler tespit etmek ve analiz etmek için kullanıldı Bollampalli ve ark., 3 yukarıda rapor kaynaklanan Bu CFSE tabanlı geçiş deneyi için protokol, burada tarif edilmektedir. avantaj ve bu tahlilde dezavantajları tartışılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
noDCs mikrobiyal antijen edinme ve lenfatikler yoluyla DLN göç etmek suretiyle vücut yüzeylerinde mikrobiyal meydan cevap verebilecek uzman antijen sunan hücreler vardır. Orada DH'ler primer T-hücresi tepkilerini sağlayan bir şekilde T hücreleri, bu antijeni. DLN dokudan DC göç işlemi, verimli bir T-hücresi yanıtı başlatılır nasıl çalıştığını anlamak için, bu nedenle çok önemlidir. DC migrasyonun ölçülmesi için yöntemler sonuç olarak yukarıda açılma çok yararlıdır.
Bir fare modeli, BCG, deri klinik olarak enjekte edilir canlı aşı ile enfeksiyondan sonra DLN deri DC taşıma çalışması için kullanılmıştır. uygun olarak, BCG aşısı, bu cilt yoluyla taklit etmek için bir arka ayak yastığından enjekte edilir. Basit bir deney geliştirdi ve dolayısıyla boşaltma PLN ayak tabanı deri BCG aşılama sitesinden cilt DC alt popülasyonlarının göç araştırmak için bu modele dahil oldu. Bu protokol, dinleriDaha önce BCG alınan aynı ayak tabanı içine florokrom KAKE enjekte ve sonra flow sitometri KAKE etiketli hücrelerin varlığını analiz etmek daha sonra tahliye PLN 24 saat tecrit es. Protokolde tarif olmasa da, bu kurulumdan LN ayrıca LN 3 göçmen hücrelerin konumlandırma olarak göç süreçlerini incelemek için, konfokal mikroskobu ile analiz için hazırlanabilir. Ayrıca, BCG tetiklenen cilt DC göç benzer sonuçlar BCG hem Pasteur 1173P2 3 ve BCG SSI 1331 14 kullanılarak elde edilmiştir.
CFSE, genellikle in vitro hücreleri etiketlemek için ve hücre transferi 15 sonra in vivo bu etiketlenmiş hücreleri izlemek için kullanılır. Ama mevcut protokol, doğrudan yerinde deri hücreleri etiketlemek için kullanıldı. CFSE etiketleme moleküler, aynı zamanda, bir amin-reaktif fluoresan boya olan FITC, benzer. o CRE olarak KAKE ancak konjugasyon için FITC tercih edilirates çok kararlı karboksamid bağlar 16. Ayrıca, CFSE yüksek membran geçirgen ve pasif olarak hücre içine girer. İçerde, hücre içi amin (floresan) etiketli hücrede 15 korunur konjugatları oluşturur.
yazarlar tarafından geliştirilen CFSE bazlı göçü deneyi BCG yanıt olarak 24 saatlik bir süre içinde cilt DLN taşındıktan hücrelerin tanımlanmasını sağlar. Bu nedenle belirli bir zaman aralığında, akut taşıma ölçer ve bir farklı kabiliyeti açısından araştırmak sağlar, taşıma tetiklemek için uyaranlara enjekte edilmiştir. Bu deney, bir temas hassaslaştırıcı maddenin deri, topikal uygulama tarafından tetiklenen bir kümülatif göç olayı ölçen FITC cilt resminin klasik tekniği, farklıdır. Bu nedenle, CFSE tabanlı geçiş deneyi göç deri DCS veya f mikrop, mikrobiyal ürünler veya diğer enflamatuar uyarılara enjeksiyonundan sonra PLN ev diğer hücreleri tanımlamak için kullanılabilirootpad. Gerçekten de, nötrofil ve γ hem: δ T hücreleri BCG 17,18 yanıt olarak DLN deriden taşınmaya gösterilmiştir. Aslında, deney en son bir bağırsak-lokalize Nematot enfeksiyonu DLN 14 BCG tetiklenen deri DC taşıma kapatmak olabilir olduğunu göstermek için bir ko-enfeksiyon ayarı kullanıldı.
DC göç genellikle DC'ler 19 boyadıktan sonra 4 ila 5 gün tespit edilmesi zor olan FITC işaretli beri 24 FITC cilt resim saat 72 arasında değerlendirilir. Göç analizi 24 saat ile sınırlı beri etiketli DC'lerde KAKE sinyal kaybı burada sunulan analizde bir sorun değildir; Bu yazarlar, özellikle incelemek için "bir gecede" göç olayları istediğini olmanın arkasındaki nedeni. Bu deneyde ilgilenen Diğerleri ise KAKE tabanlı izleme için daha erken veya daha geç zaman noktalarında araştırmak için teşvik edilir. KAKE enjeksiyon yoluyla tanıtıldı beri Ayrıca, tanımlanmış herhangi bir zamanda verilebilir. Bu esneklik a izinuthors BCG enfeksiyonu (Şekil 2C) 3 gün sonra 5 ve 6 arasında DC taşıma değerlendirmek. Enjekte KAKE potansiyel etiketleme reaksiyonu yerinde erişilebilir hücre tipleri sınırlayabilir. Derinin üst tabakasında bulunur DC'ler olan örnek Langerhans hücrelerinin (LCs) için, epidermis, (Şekil 3) 3 KAKE tabanlı göç deneyinde BCG cevaben kötü göç ederler. Ancak, FITC cilt boyama, dermis konumlandırılmış DC'ler sırasında, epidermis altındaki tabaka kolayca etiketli ve daha hızlı LCs 20,21 den DLN göç. Bu, hücrelerin florokrom etiketli olabilir mutlaka markalama çözeltisi uygulandığında deri tabakası lokalize gerek kalmadan göstermektedir.
BCG enfeksiyonu için bir model olarak, fare kulağı daha tüberküloz aşısı olarak BCG klinik yönetimi ile uyumludur aşılama iyi niyetli bir intradermal yol sağlar. foÖte yandan otpad enjeksiyonu, muhtemelen deri içi ve deri altı yollardan bir kombinasyonudur. Yani klinik pratikte her zaman gerçek intradermal verilmesi değil subkutan ya da her ikisinin kombinasyonu olmayabilir bu yüzden doğru ve tekrarlanabilir, dermis 22 BCG teslim beceri ve eğitim gerektirir, dedi. bir aşılama sitesi olarak haydut söz liyakat kulak üzerinde iki çok net avantajları var. İlk olarak, bağışıklık tepkisi, bir ayak tabanına enjekte alttaki drenaj PLN kadar konsantre edildi ve bu tepkilerin incelenmesini kolaylaştırmaktadır. Bu raporun yazarları PLN Kapkaççı 3 boşaltma ilk ve ana LN bulundu. Diğerleri Evan mavi 23 enjeksiyonundan sonra popliteal ve subiliac LN arasındaki bölünmüş drenaj öne sürmüşlerdir. Bununla birlikte, kulağa ile ilgili olarak, orada farelerde birden fazla kulak DLN olup, bu, düzenli olarak ve 24 bulmak kolay olmayabilir. İkincisi açıkça liab getirmektedirDLN yanıtları araştırmak isteyen çalışmalarda ility. kulağa göre – (50 ul 10) ikinci ve daha büyük miktarlar ayak tabanı içine inoküle edilebilir. Bu da hem lenfatik akım büyük değişiklikler tanıtmak ve mikobakteri büyük miktarlarda aşılamak için geldiğinde başlı başına bir konudur çok küçük enjeksiyon hacimleri ile çalışmak zorunda sorumluluğu en aza indirir. enjeksiyon hacimleri küçük (1-10 ul) olması kulakta, hatta 5 ul lenfatik akımı değiştirebilir ve potansiyel kontrolsüz bir şekilde doğrudan DLN enjekte malzemenin daha büyük bir miktarda kuvvet. Enjeksiyon hacimleri hesaba önemlidir. Bu LN bakteri ferrying hücrelerin katkısını ele deneylerde özellikle önemlidir. BCG ayak tabanı modelinde, bazı BCG hücresel ulaşım yokluğunda DLn ulaşmış olabilir. Bu hala ayak farelerin DLN nerede hücre göçünü BCG algılayabilir gözlemine dayanırped tamamen boğmaca toksini 3 lokal enjeksiyonu ile ablasyon. Bu BCG doğrudan lenfatikleri erişebilir ve gerçekten hücre içermeyen bir şekilde dLn ulaşabileceği bir göstergesi olup olmadığı bu göz ardı edilemez çünkü belirlenecek kaldığı enjekte hacmi zorla lenfatiklere erişim verilen bu durumda mikobakteriler.
kulak veya ayak tabanlarından immünizasyonlar için pratik bir husus enjeksiyonu doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde gerçekleştirilebilir için hayvanların yeterli hareketsizleştirilecek olmasıdır. Isofluran gaz ayak tabanı enjeksiyonlar için hazırlık hayvanlar sınırlamaya için bir yöntem olarak mevcut protokolün açıklanmaktadır. Izofluran-aracılı anestezi için nispeten hızlı indüksiyon ve derlenme süreleri popüler bir yöntem yapmak, ancak diğer anestezik ajanların benzer deneysel sonuçlarla 25 engel olabilir fizyolojisini etkiler. Nitekim, uçucu ve enjekte iki anestezi kaldırarak lenf akışını azaltmakistemli kas hareketleri, kas tonusunu azaltarak ve lymphangion kasılmasını 26 azalan. Ayrıca, adoptif ayak tabanı transfer DClerin DLN göç bir 5 misli azalma anestezi altındaki hayvanlara 27 bildirilmiştir. Yukarıda verilen ve önceki anestezi kullanım prosedürleri yana yönetmek için, hem seri ve bir geri kazanım aşaması gerektirmeyen enjeksiyon kendisi daha hayvanlara daha fazla strese neden muhtemeldir olasılığı yeterince anestezi olmadan hayvan sınırlamaya gerektiği kabul edilebilir. Hayvan hızla 30 ila 40 saniye içinde Kapkaççı bir hareketsiz konuma getirilir ve inoküle edilebilir ayak tabanında enjeksiyonları için özelleştirilmiş bir fare süzgeç sürecindeki fizyolojisi diğer yönlerini değiştirmeden arka ayak yastığından fare enjekte ideal olacaktır ve lenfatikler yoluyla hücre göçü ele çalışmalarda son derece yararlı olacaktır.
Sonuç olarak, bu raportanımlanmış bir 24 saatlik penceresi sırasında göç izleyen bir testi kullanılarak DLN kendi seferberlik sırasında cilt DC'ler izlemek için yeni bir protokol vurgulamaktadır. Bu KAKE tabanlı göç tahlil burada ayrıntılı olarak, flow sitometri yanı sıra konfokal mikroskopi 3 ile algılama ve göçmen hücrelerin analiz sağlar. Bu enjekte uyaranlara çeşitli ve DC göçü tetikleyecek kabiliyetlerini incelemek için esnek bir platform sağlar, ve daha da önemlisi, DCler aynı zamanda farklı deneysel ayarları sırasında DLN deriden hareketli diğer popülasyonlar sadece izlemek için kullanılabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Karolinska Institutet, a project grant from the Swedish Research Council VR (Dnr 2014-2794) and a KID Doctoral Grant from Karolinska Institutet (All to A.G.R). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) |
Invitrogen | C1157 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Bacille Calmette-Guérin (BCG) | strain Pasteur, in house | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| EDTA | In house | ||
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | In house | ||
| Filtered water | In house | ||
| BD Plastipak 3 ml syringe | BD Medical Surgical Systems | 309658 | alternative: 5 ml syringe |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 15 ml centrifuge tubes | TPP | 91015 | Polypropylene |
| 5 ml round bottom tubes | BD Falcon | 3272948 | Polystyrene |
| Univentor 400 anaesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
| Monojet 3/10ml syringe | Medicarrier | 8881511144 | 29 G x 1/2 in. |
| Sterile filter unit | TPP | 99500 | PES membrane |
| EPPI-Pistill homogenizer | Schuett biotech | 3.200 512 | Polypropylene |
| Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B01145 | |
| Bürker counting chamber | VWR | 631-0920 | |
| 0.5 ml screw cap microtube | Sarstedt | 72.730 | Polypropylene |
| 1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube | VWR | 700-5239 | Polypropylene |
| 70 micron cell strainers | VWR | 734-0003 | |
| BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software | BD Biosciences | Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed | |
| FlowJo cell analysis software | Tree Star | ||
| Antibody | Clone | Company | |
| Antibodies | |||
| MHC-II I-A/I-E | M5/114.15.2 | BD Biosciences | |
| CD11b | M1/70 | BD Biosciences | |
| CD11c | HL3 | BD Biosciences | |
| CD16/CD32 (Fc-block) | 2.4G2 | BD Biosciences | |
| CD326/EpCAM | G8.8 | Biolegend | |
| CD103 | 2E7 | Biolegend | |
| CD80 | 16-10A1 | Biolegend | |
| CD86 | GL-1 | Biolegend |
References
- Platt, A. M., Randolph, G. J. Dendritic cell migration through the lymphatic vasculature to lymph nodes. Adv Immunol. 120, 51-68 (2013).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Bollampalli, V. P., et al. BCG Skin Infection Triggers IL-1R-MyD88-Dependent Migration of EpCAMlow CD11bhigh Skin Dendritic cells to Draining Lymph Node During CD4+ T-Cell Priming. PLoS Pathog. 11, e1005206 (2015).
- Allan, R. S., et al. Migratory dendritic cells transfer antigen to a lymph node-resident dendritic cell population for efficient CTL priming. Immunity. 25, 153-162 (2006).
- Itano, A. A., et al. Distinct dendritic cell populations sequentially present antigen to CD4 T cells and stimulate different aspects of cell-mediated immunity. Immunity. 19, 47-57 (2003).
- Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Laboratory maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit 10A 11 (2007).
- Tung, J. W., et al. Modern flow cytometry: a practical approach. Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).
- Sharrow, S. O. Overview of flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.1 (2002).
- Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. Preparation of cells and reagents for flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.3 (2001).
- Henri, S., et al. The dendritic cell populations of mouse lymph nodes. J Immunol. 167, 741-748 (2001).
- Diacovo, T. G., Blasius, A. L., Mak, T. W., Cella, M., Colonna, M. Adhesive mechanisms governing interferon-producing cell recruitment into lymph nodes. J Exp Med. 202, 687-696 (2005).
- Henri, S., et al. Disentangling the complexity of the skin dendritic cell network. Immunol Cell Biol. 88, 366-375 (2010).
- Obieglo, K., et al. Chronic Gastrointestinal Nematode Infection Mutes Immune Responses to Mycobacterial Infection Distal to the Gut. J Immunol. 196 (5), (2016).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, Unit4.9 (2009).
- Banks, P. R., Paquette, D. M. Comparison of three common amine reactive fluorescent probes used for conjugation to biomolecules by capillary zone electrophoresis. Bioconjug Chem. 6, 447-458 (1995).
- Nakamizo, S., et al. Dermal Vgamma4(+) gammadelta T cells possess a migratory potency to the draining lymph nodes and modulate CD8(+) T-cell activity through TNF-alpha production. J Invest Dermatol. 135, 1007-1015 (2015).
- Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106, 1843-1850 (2005).
- Thomas, W. R., Edwards, A. J., Watkins, M. C., Asherson, G. L. Distribution of immunogenic cells after painting with the contact sensitizers fluorescein isothiocyanate and oxazolone. Different sensitizers form immunogenic complexes with different cell populations. Immunology. 39, 21-27 (1980).
- Shklovskaya, E., Roediger, B., Fazekasde St Groth, B. Epidermal and dermal dendritic cells display differential activation and migratory behavior while sharing the ability to stimulate CD4+ T cell proliferation in vivo. J Immunol. 181, 418-430 (2008).
- Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22, 643-654 (2005).
- Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332, 170-174 (2008).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53, E55-E69 (2012).
- Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiol Rev. 70, 987-1028 (1990).
- Tal, O., et al. DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling. J Exp Med. 208, 2141-2153 (2011).
