Un ensayo basado en CFSE para estudiar la migración de la piel murina de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje durante la infección con<em> Mycobacterium bovis</em> Bacilo de Calmette-Guérin

NODC son células presentadoras de antígeno especializadas que pueden responder a la exposición microbiana en las superficies del cuerpo mediante la adquisición de antígeno microbiano y la migración a través de los vasos linfáticos DLN. Allí, DCs presentan este antígeno a las células T de una manera que conduce a respuestas de células T primarias. El proceso de migración de DC a partir de tejido de DLN es por lo tanto muy importante para la comprensión de cómo se inicia una respuesta de células T productiva. Métodos para medir la migración de CC son por lo tanto muy útil en el desarrollo de lo anterior.

Se empleó un modelo de ratón para estudiar la migración de la piel DC a DLN después de la infección con BCG, una vacuna viva que se inyecta en la piel clínicamente. En consonancia, la BCG se inyecta en la pata trasera para imitar esta vía cutánea de la vacunación. Un simple ensayo fue desarrollado y por lo tanto incorpora a este modelo para investigar la migración de la piel DC subpoblaciones desde el punto de inoculación de BCG en la piel de la almohadilla plantar al PLN drenaje. Este protocolo relies en inyectar el fluorocromo CFSE en la misma almohadilla de la pata que recibió previamente BCG y luego aislar el drenaje PLN 24 horas más tarde para analizar la presencia de células marcadas con CFSE por citometría de flujo. Aunque no se describe en el protocolo, los LN de esta configuración también se pueden preparar para el análisis por microscopía confocal, para estudiar los procesos de migración, como el posicionamiento de las células migratorias en la LN ^3. Además, los resultados similares en la migración DC piel provocada por BCG han sido obtenidos utilizando tanto BCG Pasteur 1173P2 ³ y BCG SSI 1331 ^14.

CFSE se utiliza comúnmente para marcar las células in vitro y para realizar un seguimiento de este tipo de células marcadas en vivo después de las transferencias de células ^15. En el protocolo actual, sin embargo, se utiliza para etiquetar células de la piel directamente in situ. La base molecular de etiquetado CFSE es similar a FITC, que es también un colorante fluorescente reactivo con amina. CFSE Sin embargo se prefiere más de FITC para la conjugación, ya que creAtes bonos carboxamida muy estables ^16. Por otra parte, es altamente CFSE membrana permeable y pasivamente se difunde en las células. Una vez dentro, se forma intracelular amina (fluorescente) conjugados que son retenidos en la celda marcada ^15.

El ensayo de migración basada en la CFSE desarrollado por los autores permite la identificación de células se trasladan desde la piel hasta DLN en un plazo de 24 horas en respuesta a BCG. Por lo tanto, mide la migración aguda durante un período de tiempo definido y permite investigar la capacidad de los diferentes, inyecta estímulos para desencadenar la migración. Este ensayo es diferente de la técnica clásica de la pintura de la piel FITC, que mide un evento de migración acumulada provocada por cutánea aplicación, tópica de un agente de contacto es sensibilizante. Por lo tanto, el ensayo de migración a base de CFSE se puede emplear para identificar los DC de la piel u otras células migratorias que alberga el PLN después de la inyección de los microbios, productos microbianos u otros estímulos inflamatorios en el footpad. De hecho, tanto los neutrófilos y γ: delta células T se ha demostrado que trasladarse de piel para DLN en respuesta a BCG ^17,18. De hecho, el ensayo se utilizó recientemente en un entorno co-infección para mostrar que una infección por nematodos gut-localizada podría silenciar piel migración DC-desencadenó BCG a DLN ^14.

La migración de CC se evalúa a menudo entre el 24 a 72 horas en la pintura de la piel desde FITC marcado con FITC-DC son difíciles de detectar de 4 a 5 días después de pintar ^19. La pérdida de la señal de CFSE en países en desarrollo marcado no es un problema en el ensayo que aquí se presenta ya que el análisis de la migración se restringió a las 24 horas; la razón detrás de esto es que los autores querían estudiar específicamente "durante la noche" eventos de migración. Otras personas interesadas en este ensayo son, sin embargo les anima a investigar anteriores o incluso posteriores del tiempo de seguimiento basado en la CFSE. Además, dado que CFSE es introducido por inyección se puede administrar en cualquier momento definido. Esta flexibilidad permite que el unautores para evaluar la migración de CC entre los días 5 y 6 después de la infección con BCG (Figura 2 C) ^3. Inyectar CFSE potencialmente podría limitar los tipos de células accesibles in situ para la reacción de marcaje. Para las células de Langerhans (CL ejemplo), que son los DC que residen en la capa superior de la piel, la epidermis, migran mal en respuesta a BCG en el ensayo de migración basada en CFSE (Figura 3) ^3. Sin embargo, durante la pintura de la piel FITC, países en desarrollo situados en la dermis, la capa debajo de la epidermis, se marcan fácilmente y migrar a la DLN más rápido que las CL ^20,21. Esto sugiere que las células pueden llegar a ser marcado con fluorocromo sin necesariamente pueda localizar a la capa de la piel donde se aplica la solución de etiquetado.

Como modelo para la infección por el BCG, la oreja de ratón proporciona una vía intradérmica de buena fe de la inoculación que está más en línea con la administración clínica de la vacuna BCG como una vacuna contra la tuberculosis. foinyección otpad por otra parte, es probable que una combinación de la intradérmica y subcutánea. Dicho esto, requiere habilidad y entrenamiento para entregar correctamente y reproducible BCG a la dermis ^22, por lo que en la práctica clínica puede que no siempre se da realmente intradérmica sino más bien subcutánea o una combinación de ambos. Como un sitio de la inoculación de la almohadilla de la pata tiene dos ventajas muy claras sobre la oreja que merecen mención. En primer lugar, la respuesta inmune se concentra en el PLN drenaje después de una inyección de la almohadilla plantar y esto facilita el examen de las respuestas. Los autores de este informe se determinó que el PLN para ser el primero y principal LN drenaje de la almohadilla de la pata ^3. Otros han sugerido drenaje división entre los LN poplíteo y subilíacos después de la inyección de azul de Evans ^23. Sin embargo, en lo que respecta a la oreja, hay más de un oído DLN en ratones y estos puede no ser regularmente presente o fácil de localizar ^24. Este último presenta claramente un liability en los estudios que tratan de investigar las respuestas en DLN. En segundo lugar, los volúmenes más grandes se pueden inocular en la almohadilla de la pata (10 – 50 l) en comparación con la oreja. Esto a su vez minimiza tanto la responsabilidad de introducir modificaciones importantes en el flujo linfático y de tener que trabajar con volúmenes de inyección muy pequeños, lo cual es en sí mismo un problema cuando se trata de inocular grandes cantidades de micobacterias. En la oreja, donde los volúmenes de inyección tienen que ser pequeños (1-10 l), incluso 5 l pueden alterar el flujo linfático y potencialmente obligar a una mayor cantidad de material inyectado directamente en el DLN de una manera incontrolada. Por tanto, es importante tener en cuenta los volúmenes de inyección. Esto es especialmente importante en los experimentos que abordan la contribución de las células en transportar las bacterias a la LN. En el modelo de almohadilla de la pata BCG, algunos BCG puede haber alcanzado el DLN en ausencia de transporte celular. Esto se basa en la observación de que todavía se puede detectar BCG en el DLN de ratones donde la migración celular desde el piealmohadilla se realiza la ablación por completo por inyección local de la toxina pertussis ^3. Si esto es una indicación de que BCG puede acceder directamente a los vasos linfáticos y llegar a la DLN de una manera verdaderamente libre de células que queda por determinar, ya que no se puede excluir que las micobacterias en este caso en el que da acceso a los vasos linfáticos por la fuerza del volumen inyectado.

Una consideración práctica de las inmunizaciones en el oído o la almohadilla de la pata es que los animales tienen que ser inmovilizada adecuadamente para las inyecciones se lleven a cabo correctamente y de manera reproducible. el gas isoflurano se describe en el protocolo actual como un método para sujetar a los animales en la preparación para las inyecciones de la almohadilla plantar. Los tiempos de inducción y recuperación relativamente rápidos para la anestesia de isoflurano mediada lo convierten en un método popular, pero similar a otros agentes anestésicos, que afecta a la fisiología, lo que puede interferir con los resultados experimentales ^25. De hecho, los anestésicos volátiles e inyectables tanto disminuyen el flujo linfático, aboliendolos movimientos musculares voluntarios, lo que reduce el tono muscular y la disminución de la contracción lymphangion ^26. Por otra parte, una reducción de 5 veces en la migración a DLN de DCs adoptivamente transferida en la almohadilla de la pata se ha informado en animales anestesiados ^27. Teniendo en cuenta lo anterior, y puesto que los procedimientos de manipulación antes de la anestesia es probable que causen más estrés a los animales que la inyección en sí, que es a la vez rápido de administrar y no requiere una etapa de recuperación, la posibilidad de frenar adecuadamente el animal sin anestesia debe ser considerado. Un retenedor de ratón personalizado para inyecciones plantares, donde el animal puede ser llevado rápidamente a una posición inmovilizada y se inocularon en la almohadilla de la pata dentro de 30 a 40 seg sería ideal para inyectar el ratón en la almohadilla de la pata trasera sin alterar otros aspectos de su fisiología en el proceso de , y sería extremadamente útil en estudios relacionados con la migración celular a través de los vasos linfáticos.

En conclusión, este informedestaca un nuevo protocolo para el seguimiento de los DC de la piel durante su movilización a la DLN utilizando un ensayo que monitorea la migración durante una ventana de 24 horas definido. Este ensayo de migración a base de CFSE permite la detección y el análisis de las células migratorias por citometría de flujo, tal como se detalla aquí, así como por microscopía confocal ^3. Proporciona una plataforma flexible para el estudio de una variedad de estímulos inyectados y su capacidad para desencadenar la migración de DC, y esto es importante, se puede emplear para realizar un seguimiento no sólo DCs sino también otras poblaciones se mueven desde la piel a DLN durante diferentes parámetros experimentales.