Пробирного CFSE основе для изучения миграции мышиной кожи дендритных клеток в Опорожнение лимфатических узлов во время инфекции с<em> Mycobacterium Bovis</em> Кальметта-Герена

НЦОД являются специализированными антиген-представляющих клеток, которые могут реагировать на микробную вызов на поверхности тела путем приобретения микробного антигена и миграции на DLN через лимфатическую систему. Там, контроллеры домена представить этот антиген Т-клеток способом, который приводит в реакции первичных Т-клеток. Процесс миграции DC от ткани до DLN Поэтому очень важно для понимания того, как инициируется продуктивный Т-клеточный ответ. Методы измерения миграции постоянного тока, следовательно, очень полезны в разворачивание выше.

Мышиная модель была использована для изучения кожи DC миграцию к DLN после заражения БЦЖ, живой вакцины, которая впрыскивается клинически в коже. В строке, БЦЖ вводится в заднюю лапу, чтобы имитировать этот кожный маршрут вакцинации. Простой анализ был разработан и, следовательно, включены в эту модель для изучения миграции кожи DC подгруппах из прививка БЦЖ сайта в подушечку кожи к дренажным злотый. Этот протокол RELIЕ. С. по инжекции Флуорохром CFSE в ту же лапу, что ранее полученного БЦЖ, а затем выделяют водосточные Pln 24 ч позже для анализа присутствия CFSE-меченых клеток с помощью проточной цитометрии. Хотя это и не описано в протоколе, LNS из этой установки также могут быть получены для анализа с помощью конфокальной микроскопии, для изучения процессов миграции , таких как позиционирование миграционных клеток в LN ^3. Кроме того, аналогичные результаты по БЦЖ-триггерным кожи миграции постоянного тока были получены с использованием обоих BCG Пастера 1173P2 ³ и БЦЖ SSI 1331 ^14.

CFSE обычно используется для обозначения клеток в пробирке и отслеживать такие меченых клеток в естественных условиях после клеточных передач ^15. В текущем протоколе , хотя, он был использован непосредственно маркировать клетки кожи на месте. Молекулярные основы маркировки CFSE подобна FITC, который также амин-реактивным флуоресцентный краситель. CFSE Однако предпочтительно над FITC для конъюгации, как это создАтес очень стабильные карбоксамидных облигации ^16. Кроме того, CFSE сильно мембрана проницаема и пассивно диффундирует в клетки. Оказавшись внутри, он образует внутриклеточное амин (флуоресцентные) конъюгаты, сохраняющиеся в меченую клетку ^15.

CFSE на основе анализа миграции, разработанная авторами позволяет идентифицировать клетки, перемещающих от кожи до DLN в течение 24-ч в ответ на БЦЖ. Таким образом, он измеряет острую миграцию в течение определенного периода времени и позволяет исследовать способность различных, впрыскивается стимулы, чтобы вызвать миграцию. Этот анализ отличается от классической методики FITC живописи кожи, который измеряет кумулятивный событие миграции, спровоцированные кожное, местного применения контактного сенсибилизирующее агента. Таким образом, анализа миграции CFSE на основе могут быть использованы для идентификации мигрирующие кожи или DCs другие клетки, которые домой к Pln после инъекции микробов, микробные продукты или другие воспалительные стимулы в диафрагменноеootpad. Действительно, оба нейтрофилы и γ: d Т – клетки , было показано , что переселиться из кожи DLN в ответ на БЦЖ ^17,18. На самом деле, анализ недавно был использован в условиях ко-инфекции , чтобы показать , что кишка локализованы нематодозы может приглушить БЦЖ-триггерным кожи миграции постоянного тока к DLN ^14.

Миграция DC часто оценивается от 24 до 72 ч в FITC живописи кожи , так как FITC-меченого контроллеры домена трудно обнаружить от 4 до 5 дней после покраски ^19. Потеря сигнала CFSE на меченой РС не является проблемой в анализе, представленном здесь, так как анализ миграции был ограничен до 24 часов; причина этого в том, что авторы хотели специально изучать «овернайт» миграционные события. Другие заинтересованные в этом анализе, однако, рекомендуется изучить более ранние или даже более поздние моменты времени для отслеживания CFSE основе. К тому же, так как CFSE вводят путем инъекции может быть дано в любое заданное время. Такая гибкость позволила Authors для оценки миграции постоянного тока между 5 -й день и 6 после БЦЖ – инфекции (рис 2C) ^3. Инъекционное CFSE потенциально может ограничить типы клеток , доступные на месте по отношению к реакции мечения. Например клеток Лангерганса (LCS), которые являются контроллеры домена , которые находятся в верхнем слое кожи, эпидермис, мигрировать плохо в ответ на БЦЖ анализа миграции CFSE основе (рисунок 3) ^3. Тем не менее, во время кожи картины FITC, контроллеры домена , расположенных в дерме, слой под эпидермисом, легко маркировать и мигрируют к DLN быстрее , чем LCs ^20,21. Это говорит о том, что клетки могут стать меченное флуорохромом не обязательно необходимости локализовать к слою кожи, где применяется раствор маркировки.

В качестве модели для БЦЖ – инфекции, ухо мыши обеспечивает добросовестное внутрикожный прививки , который является более в соответствии с клинического применения БЦЖ в качестве вакцины туберкулеза. Foотпад инъекции с другой стороны, это, вероятно, сочетание внутрикожного и подкожный пути. Тем не менее, это требует навыков и подготовки , чтобы правильно и воспроизводимо доставить БЦЖ в дерму ^22, так что в клинической практике это не всегда может быть дано по- настоящему внутрикожное , а скорее подкожное или комбинацией обоих. В качестве сайта инокуляции подушечку имеет два очень явные преимущества над ухом, которые заслуживают упоминания. Во-первых, иммунный ответ сосредоточен на дренажного Pln следующей инъекции в подушечку лапы и это облегчает изучение ответов. Авторы этого доклада нашли злотый быть первым и основным LN сливе подушечку ^3. Другие предложили раскол дренаж между подколенной и LNs после того, как расположенный под подвздошной костью инъекции Эван синий ^23. Тем не менее, в отношении уха, есть более чем одно ухо DLN у мышей , и они не могут быть регулярно присутствовать или легко определить местонахождение ^24. Последнее явно вводит liability в исследованиях, стремящихся расследовать ответы в DLN. Во-вторых, большие объемы могут быть привиты в подушечку лапки (10 – 50 мкл) по сравнению с ухом. Это, в свою очередь, сводит к минимуму как ответственность введения основных изменений в лимфоток и того, чтобы работать с очень малыми объемами впрыска, что само по себе является проблемой, когда речь идет о посеве большого количества микобактерий. В ухе, где объем вводимого препарата должно быть небольшим (1-10 мкл), даже в 5 мкл может изменять лимфатического потока и потенциально заставить большее количество впрыскиваемого материала непосредственно в DLN бесконтрольно. Поэтому важно учитывать объемов закачки. Это особенно важно в экспериментах, касающихся вклада клеток в перегона бактерии к LN. В модели подушечку лапы БЦЖ, некоторые БЦЖ, возможно, достиг дина в отсутствии клеточного транспорта. Это основано на наблюдении, что можно обнаружить еще БЦЖ в DLN мыши, где миграцию клеток от стопынакладка была полностью удалена с помощью местной инъекции токсина коклюша ^3. Является ли это указывает на то, что БЦЖ может непосредственно получить доступ к лимфатические сосуды и достигают дина в истинно бесклеточной способом остается определить, так как оно не может быть исключено, что микобактерии в данном случае, когда предоставляется доступ к лимфатическим сосудам силой Вводимый объем.

Практическое рассмотрение для вакцинаций в ухе или подушечку в том, что животные должны быть надлежащим образом иммобилизованные для инъекций, чтобы быть выполнена правильно, и воспроизводимым образом. Isoflurane газа описан в текущем протоколе в качестве способа сдерживать животных в рамках подготовки к подушечку инъекций. Относительно быстрая индукция и время восстановления для изофлурановой-опосредованной анестезии делают его популярным методом, но по аналогии с другими анестетиками, это влияет на физиологию, которая может помешать с экспериментальными результатами ^25. Действительно, как летучие и инъекционные анестетики уменьшают лимфоток, упразднивпроизвольные движения мышц, снижение мышечного тонуса и уменьшение лимфангиона сжатия ^26. Кроме того, сокращение в 5 раз в миграции к DLN ДК адаптивно переносили в подушечку было сообщено в наркотизированных животных ^27. С учетом вышеизложенного, и поскольку процедуры обработки до начала анестезии, вероятно, вызовет больше напряжения в организме животных, чем сама инъекция, которая является одновременно быстрым для администрирования и не требует стадии восстановления, возможность адекватно сдерживать животное без наркоза должен быть на рассмотрении. Удерживающим мышь настроена для подушечку инъекции, где животное может быть быстро доведена до иммобилизованной положение и инокулировали в подушечку лапы в пределах от 30 до 40 сек будет идеальным впрыснуть мышь в заднюю лапу, не изменяя другие аспекты его физиологии в процессе , и было бы чрезвычайно полезным при изучении адресации миграции клеток через лимфатическую систему.

В заключение, в настоящем докладевыдвигает на первый план новый протокол для отслеживания контроллеров домена кожи во время их мобилизации в DLN с использованием анализа, который контролирует миграцию в течение определенного окна 24-часовой. Эта CFSE на основе анализа миграции позволяет обнаруживать и анализировать мигрирующие клетки с помощью проточной цитометрии, как подробно описано здесь, а также с помощью конфокальной микроскопии ^3. Он обеспечивает гибкую платформу для изучения разнообразных инжектированных раздражителей и их способность не вызывают миграцию постоянного тока, и, что важно, может быть использован для отслеживания не только РС, но и другие группы населения, перемещающихся с кожи к DLN во время различных экспериментальных установок.