Um ensaio baseado em CFSE para estudar a migração de Murino pele as células dendríticas em drenagem gânglios linfáticos durante a infecção com<em> Mycobacterium bovis</em> Bacilo de Calmette-Guérin

noDCs são células apresentadoras de antígeno especializados que podem responder a desafio microbiano em superfícies do corpo através da aquisição de antígeno microbiano e migrar para o DLN via vasos linfáticos. Há, DCs apresentar este antigénio para células T de um modo que conduz a respostas de células T primárias. O processo de migração de DC a partir de tecido de DLN é, portanto, muito importante para a compreensão de como uma resposta das células T de produção é iniciada. Métodos para medir a migração DC são, consequentemente, muito útil no desdobramento do acima.

Um modelo de ratinho foi utilizado para estudar a migração pele DC de DLN após a infecção com BCG, uma vacina viva que é injectado na pele clinicamente. Em consonância, a BCG é injetada na pata traseira para imitar esta via cutânea de vacinação. Um ensaio simples foi desenvolvido e, consequentemente incorporadas a este modelo para investigar a migração de pele DC sub-populações de local da inoculação do BCG na pele pata ao PLN drenagem. Este protocolo reliES em injectar o CFSE fluorocromo na mesma pata que previamente receberam BCG e, em seguida, isolar o PLN de drenagem 24 horas mais tarde para analisar a presença de células marcadas com CFSE-por citometria de fluxo. Embora não seja descrito no protocolo, LNs desta configuração também podem ser preparados para a análise por microscopia confocal, para o estudo de processos de migração, tais como o posicionamento das células migratórias na LN ^3. Além disso, resultados semelhantes na pele BCG-desencadeou a migração DC foram obtidos usando tanto BCG Pasteur 1173P2 ³ e BCG SSI 1331 ^14.

CFSE é comumente usado para marcar as células in vitro e para acompanhar tais células marcadas in vivo após a transferência de células ^15. No protocolo atual, porém, ele foi usado para rotular diretamente as células da pele in situ. A base molecular de rotulagem CFSE é semelhante a FITC, o qual também é um corante fluorescente reactivo com amina. CFSE no entanto é preferido em relação FITC para conjugação, pois creates títulos carboxamida muito estáveis ^16. Além disso, é altamente CFSE membrana permeável e difunde passivamente nas células. Uma vez lá dentro, ele forma amina intracelular (fluorescente) conjugados que são retidos na célula rotulada ^15.

O ensaio de migração à base de CFSE desenvolvido pelos autores permite a identificação de células transferidos de pele de DLN dentro de um período de 24 horas, em resposta ao BCG. Ele mede assim a migração aguda durante um período de tempo definido e permite determinar a capacidade de diferente, injetado estímulos para provocar a migração. Este ensaio é diferente da técnica clássica de FITC pintura da pele, o qual mede um evento de migração cumulativa desencadeada por aplicação cutânea, tópica de um agente sensibilizador de contacto. Assim, o ensaio de migração baseados em CFSE pode ser empregue para identificar as DCs migratórias pele ou outras células que abriga o PLN após a injecção de micróbios, produtos microbianos ou outros estímulos inflamatórios na footpad. Na verdade, ambos os neutrófilos e γ: ô células T têm sido mostrados para mudar a partir de pele de DLN em resposta a BCG ^17,18. Na verdade, o ensaio foi recentemente utilizado num contexto co-infecção para demonstrar que uma infecção localizada-nemátodo intestinal pode silenciar pele migração DC BCG-desencadeada de DLN ^14.

Migração de DC é frequentemente avaliado entre 24 a 72 horas na pele uma vez que FITC pintura marcado com FITC DCs são difíceis de detectar 4 a 5 dias após a pintura ^19. A perda do sinal de CFSE em DCs marcado não é um problema no ensaio aqui apresentadas uma vez que a análise de migração foi restringido a 24 h; a razão por trás disso é que os autores queriam estudar especificamente "overnight" eventos de migração. Outros interessados ​​neste ensaio são no entanto encorajados a investigar anteriores ou posteriores, mesmo para os pontos de tempo de seguimento com base em CFSE. Além disso, uma vez que é introduzido CFSE por injecção pode ser administrada em qualquer altura definida. Esta flexibilidade permitida a umuthors para avaliar a migração DC entre o dia 5 e 6 após a infecção com BCG (Figura 2C) ^3. Injectar CFSE poderia potencialmente limitar os tipos de células acessíveis in situ para a reacção de marcação. Por exemplo, as células de Langerhans (LCS), que são as DCs que residem na camada superior da pele, a epiderme, migram deficientemente em resposta à BCG no ensaio de migração baseados em CFSE (Figura 3) ^3. No entanto, durante a exposição da pele com FITC, as DCs posicionado na derme, a camada inferior da epiderme, são prontamente marcado e migrar para o DLN mais rápido do que CLs ^20,21. Isto sugere que as células podem tornar-se com fluorocromo marcado sem necessariamente necessidade de localizar na camada de pele, onde a solução de marcação é aplicado.

Como um modelo para a infecção por BCG, a orelha de rato fornece uma via intradérmica de boa fé de inoculação que está mais de acordo com a administração clínica de BCG como uma vacina contra a tuberculose. footpad injecção, por outro lado, é provavelmente uma combinação de via intradérmica e subcutânea. Dito isto, requer habilidade e treinamento para entregar corretamente e reprodutível BCG para a derme ^22, de modo que na prática clínica pode não ser sempre verdade intradérmica mas sim subcutânea ou uma combinação de ambos. Como um local de inoculação da pata tem duas vantagens muito claras sobre a orelha que merecem menção. Primeiro, a resposta imunitária é concentrada ao PLN de drenagem na sequência de uma injecção na pata e isto facilita a análise das respostas. Os autores deste relatório constatou o PLN para ser o primeiro e principal LN drenagem da pata ^3. Outros sugeriram drenagem divisão entre os poplítea e subiliac linfonodos após a injeção de Evan azul de ^23. No entanto, no que diz respeito ao ouvido, não é mais do que uma orelha DLN em ratinhos e estes não podem ser regularmente presente ou fácil de localizar ^24. Este último apresenta claramente um PASSility em estudos que buscam investigar respostas em DLN. Em segundo lugar, os volumes maiores podem ser inoculados na almofada da pata (10 – 50 pi) comparado com o ouvido. Este, por sua vez, tanto minimiza a responsabilidade de introduzir grandes alterações no fluxo linfático e de ter que trabalhar com volumes muito pequenos de injeção, o que é em si um problema quando se trata de inoculação de grandes quantidades de micobactérias. Na orelha, onde o volume de injecção tem que ser pequena (1-10 ul), 5 ul mesmo pode alterar o fluxo linfático e potencialmente forçar uma quantidade maior do material injectado directamente no DLN de uma maneira descontrolada. Por conseguinte, é importante para ter em conta o volume de injecção. Isto é especialmente importante em experiências abordando a contribuição de células em bactérias transportando ao LN. No modelo da pata traseira com BCG, BCG alguns podem ter atingido o DLN na ausência de transporte celular. Isto baseia-se na observação de que pode-se ainda detectar BCG na DLN de ratinhos, onde a migração de células a partir do pépad foi totalmente ablação por injeção local de toxina pertussis ^3. Se esta é uma indicação de que a BCG pode aceder directamente linfáticos e chegar ao DLN de uma forma verdadeiramente livre de células continua a ser determinado, uma vez que não pode ser excluída a possibilidade de micobactérias neste caso onde o acesso a vasos linfáticos dada pela força do volume injectado.

A consideração prática para imunizações na orelha ou pata é que os animais têm de ser devidamente imobilizado por injeções de ser efectuada correctamente e de forma reprodutível. gás isoflurano é descrito no protocolo de corrente como um método de restringir os animais em preparação para injecções almofada da pata. Os tempos de indução e recuperação relativamente rápidas para anestesia isoflurano mediada por torná-lo um método popular, mas semelhante a outros agentes anestésicos, afeta a fisiologia, o que pode interferir com os resultados experimentais ^25. Na verdade, os anestésicos tanto voláteis e injetáveis ​​diminuir o fluxo de linfa, abolindomovimentos voluntários dos músculos, reduzindo o tônus muscular e diminuindo a contração lymphangion ^26. Além disso, uma redução de 5 vezes na migração de DLN de DCs adoptivamente transferidos na almofada da pata foi avaliado em animais anestesiados ^27. Dado o acima, e uma vez que os procedimentos de manuseamento antes da anestesia são susceptíveis de causar mais stress para os animais do que a própria injecção, o que é tanto rápida para administrar e não exige uma etapa de recuperação, a possibilidade de conter adequadamente o animal sem anestésicos devem ser considerado. Um limitador do mouse personalizado para injeções coxins plantares, onde o animal pode ser rapidamente trazidos para uma posição imobilizada e inoculados na pata dentro de 30 a 40 segundos seria o ideal para injetar o mouse na pata traseira sem alterar outros aspectos de sua fisiologia no processo e seria extremamente útil em estudos que abordam a migração de células através de vasos linfáticos.

Em conclusão, este relatóriodestaca um protocolo novo para rastrear DCs pele durante a sua mobilização para a DLN utilizando um ensaio que monitora a migração durante uma janela de 24 horas definido. Este ensaio à base de migração CFSE permite a detecção e análise das células migratórias por citometria de fluxo, tal como descrito aqui, bem como por microscopia confocal ^3. Ele proporciona uma plataforma flexível para o estudo de uma grande variedade de estímulos injectados e a sua capacidade para provocar a migração DC, e mais importante, pode ser empregue para controlar não só as DCs mas também outras populações que se deslocam a partir de pele de DLN durante diferentes configurações experimentais.