での感染の間に流入領域リンパ節へのマウスの皮膚樹状細胞の移動を研究するためにCFSEベースアッセイ<em>マイコバクテリウム・ボビス</em>カルメット - ゲラン

noDCsは、微生物抗原を取得し、リンパ管を経由してDLNに移行することにより、体表面での微生物の課題に対応できる専門的な抗原提示細胞です。そこに、DCは、一次T細胞応答を駆動するようにしてT細胞にこの抗原を提示します。組織からDLNへのDC移行のプロセスは、したがって、生産性のT細胞応答が開始される方法を理解するために非常に重要です。 DCの遊走を測定するための方法は、結果として、上記の展開に非常に有用です。

マウスモデルは、BCG、皮膚に臨床的に注入される生ワクチンによる感染後のDLNに皮膚DCの遊走を研究するために使用されました。ラインでは、BCGワクチン接種のこの皮膚経路を模倣するために後肢足蹠に注入されます。単純なアッセイを開発し、その結果、排水PLNへの足蹠皮膚におけるBCGの接種部位から皮膚DCサブ集団の移行を調査するために、このモデルに組み込まれました。このプロトコルRELI以前にBCGを受けた同一の足蹠に蛍光色素CFSEを注入した後、フローサイトメトリーによりCFSE標識細胞の存在を分析するために、後に排出PLN 24時間の単離にエス。プロトコールに記載されていないが、この設定からLNSはまた、LN ³における遊走細胞の位置決めとしてマイグレーション・プロセスを研究するために、共焦点顕微鏡による分析のために調製することができます。また、BCG-トリガー皮膚DC遊走に対する同様の結果は、BCGパスツール1173P2 ³とBCG SSI 1331年¹⁴両方を使用して得られています。

CFSEは、一般的に、インビトロで細胞を標識するために、セル転送¹⁵の後に、インビボでのそのような標識された細胞を追跡するために使用されます。しかし現在のプロトコルでは、直接インサイチュで皮膚細胞を標識するために使用しました。 CFSE標識の分子基盤はまた、アミン反応性蛍光色素であるFITCに似ています。 CFSEは、しかし、それCREとしての結合のために、FITCよりも好ましいですATE非常に安定カルボキサミド債^16。また、CFSEは非常に膜透過性であり、受動的に細胞内に拡散します。いったん内部には、細胞内のアミン（蛍光）標識されたセル¹⁵内に保持された抱合体を形成します。

筆者らが開発したCFSEベースの移動アッセイは、BCGに応答して、24時間の期間内に皮膚からDLNに移転細胞の同定を可能にします。したがって、定義された期間中に急性遊走を測定し、1つは、異なる能力を調査することができ、移行をトリガするために刺激を注入しました。このアッセイは、接触感作剤の皮膚、局所適用によってトリガー累積移行イベントを測定FITC皮膚絵画の古典的な手法とは異なります。したがって、CFSEに基づく遊走アッセイは、微生物、微生物産物又はFで他の炎症性刺激の注射後のPLNにホーム遊走皮膚DCまたは他の細胞を同定するために使用することができますootpad。実際、好中球およびγの両方：δT細胞は、BCG ^17,18に対応して皮膚からDLNに移転することが示されています。実際には、アッセイは、最近、腸局在線虫感染はDLN ¹⁴にBCG-トリガ皮膚DCの遊走をミュートできたことを示すために同時感染の設定に使用しました。

FITC標識DCは^19を塗装した後4〜5日を検出することが困難であるため、DCの移行は、多くの場合、FITC皮膚の絵に24〜72時間の間で評価されます。移動の分析は24時間に制限されたため、ラベルされたDC上のCFSE信号の損失は、ここで提示アッセイでは問題ありません。この背後にある理由は、著者が特に「一晩」移行イベントを勉強したいと思ったことです。この検定に興味を持って他の人は、しかし、CFSEベースの追跡のために、以前の、あるいは後の時点を調査することが推奨されます。 CFSEは、注射によって導入されるので、それは、任意の定義された時間に与えることができます。この柔軟性は、Aを許可しましたBCG感染（ 図^2C）3日後に5と6の間のDCの移行を評価するuthors。 CFSEを注入することは、潜在的に標識反応にその場でアクセス可能な細胞タイプを制限することができます。皮膚の最上層に存在する樹状細胞であるインスタンスランゲルハンス細胞（LCS）、のために、表皮は、CFSEベースの移行アッセイにおけるBCGに対する応答（ 図^3）3で不完全に移行します。しかし、FITC皮膚塗装の際に、真皮内に配置されたDCは、表皮の下の層は、容易にラベル付けされており、より高速のLC ^20,21よりもDLNに移行します。これは、細胞が、必ずしも標識溶液が適用される皮膚の層に局在化することなく、蛍光標識になることを示唆しています。

BCG感染のモデルとして、マウスの耳には、より多くの結核ワクチンとしてBCGの臨床管理に沿ったものである接種の善意の皮内経路を提供します。フォー一方、otpad注入は、おそらく皮内および皮下経路の組み合わせです。つまり、臨床現場では、常に本当に皮与えられるのではなく皮下または両方の組み合わせではないかもしれので、それは、正確かつ再現性真皮²²にBCGを提供するためにスキルと訓練を必要とする、と述べました。接種部位としてはフットパッドは言及に値する耳の上に2つの非常に明確な利点を持っています。まず、免疫応答は、足蹠注射後の排水PLNまで濃縮し、これは、応答の検査を容易にされています。この報告書の著者は、PLNは、フットパッド^3を排出^する第一及び主LNであることが判明しました。その他は、エバンスブルー²³の注入後の膝窩と腸骨下部のLNを間分割排水を示唆しています。それにもかかわらず、耳に関してで、そこにマウスで複数の耳DLNであり、これらは、定期的に存在するか、または^24を見つけることは容易ではないかもしれません。後者は明らかにliabを紹介しますDLNにおける応答を調査するために求めている研究でility。耳に比べて – （50μlの10）第二に、より大きなボリュームは足蹠に接種することができます。これにより、リンパの流れの主要な変更を導入すると、それ自体が、それはマイコバクテリアを大量に接種することになる問題である非常に小さな注入量、で動作することの責任を最小限に抑えることの両方。注入量が小さい（1-10μl）をしなければならない耳でも5μlをリンパの流れを変えることができ、潜在的に制御されていない方法で直接DLNに注入材料を大量に強制します。注入量を考慮することが重要です。これは、LNに細菌を運んで細胞の寄与に取り組む実験では特に重要です。 BCGの足蹠モデルでは、いくつかのBCGは、細胞輸送の非存在下でDLNに達していてもよいです。これは、1つは、まだ足の細胞遊走マウスのDLNにBCGを検出することができるという観察に基づいていますパッドは完全に百日咳毒素³の局所注射によって切除されました。これはBCGが直接リンパ管にアクセスして、真の無細胞の方法でDLNに達することができるという指示があるかどうか、それを排除することはできませんので、まだ決定されていないその注入量の力によってリンパ管へのアクセス権を与えられ、この場合のマイコバクテリア。

耳または足蹠での免疫化のための実用的な考慮事項は、動物が十分に正確かつ再現可能な方法で実施される注射のために固定化されなければならないことです。イソフルランガスは、足蹠注射の準備のために動物を抑制するための方法として、現在のプロトコルに記載されています。イソフルラン媒介麻酔のための比較的迅速な誘導と回復時間は、一般的な方法にするが、他の麻酔薬と同様に、それは実験結果²⁵に干渉する可能性が生理学に影響します。確かに、揮発性および注射用の両方の麻酔薬は、廃止によってリンパの流れを減少させます自発的な筋肉の動き、筋肉の緊張を軽減し、lymphangion収縮^26を減少させます。さらに、養子足蹠に転送DCのDLNへの移行中に5倍の減少が²⁷麻酔した動物で報告されています。上記を考慮すると、麻酔前に取り扱い手順ので、管理が両方迅速であり、回収工程を必要とせず、注射自体、より動物に多くのストレスを引き起こす可能性があり、可能性は十分に麻酔なしで動物を拘束するべき考慮されます。動物は急速に30〜40秒以内にフットパッドに固定化された位置に持ってきて接種することができる足蹠注射のためにカスタマイズされたマウスレストレーナーは、プロセスにその生理​​機能の他の側面を変更することなく、後肢足蹠でマウスを注入するのに理想的です、およびリンパ管を介して細胞移動に対処する研究において非常に有用であろう。

結論として、この報告書定義された24時間のウィンドウの間の移行をモニターするアッセイを使用してDLNへの動員中に皮膚のDCを追跡するための新規のプロトコルを強調しています。このCFSEベースの遊走アッセイは、共焦点顕微鏡³により、ここで詳述されるように、フローサイトメトリーによって遊走細胞の検出および分析を可能にするだけでなく、。これは、注入された種々の刺激及びDCの遊走を誘発する能力を研究するための柔軟なプラットフォームを提供し、重要なことに、DCだけでなく、種々の実験の設定時DLNに皮膚から移動する他の集団ではないだけを追跡するために使用することができます。