Ein CFSE-basierten Assay die Migration von murinen Haut Dendritischen Zellen in Lymphknoten während der Infektion zu studieren mit<em> Mycobacterium bovis</em> Bazillus Calmette-Guérin

noDCs sind spezialisierte Antigen-präsentierende Zellen, die auf mikrobielle Herausforderung an Körperoberflächen durch den Erwerb von mikrobiellen Antigen und die Migration auf DLN über Lymphgefäße reagieren zu können. Es stellen DCs dieses Antigens an T-Zellen in einer Weise, die primäre T-Zell-Reaktionen antreibt. Der Prozess der DC Migration von Gewebe zu DLN ist daher sehr wichtig für das Verständnis, wie ein produktives T-Zell-Antwort ausgelöst wird. Methoden DC Migration sind daher sehr nützlich, um zu messen, die oben in Entfaltung.

nach Infektion mit BCG, einem Lebendimpfstoff wurde ein Mausmodell zu studieren Haut DC Migration zu DLN eingesetzt, die klinisch in die Haut injiziert wird. Entsprechend wird BCG im hinteren Fußballen diese kutanen Weg der Impfung zu imitieren. Ein einfacher Test wurde entwickelt und damit zu diesem Modell integriert, um die Migration der Haut DC-Subpopulationen von der BCG-Impfstelle in den Fußballen Haut zur Trockenlegung pLN zu untersuchen. Dieses Protokoll Relies auf den Fluorochrom CFSE in der gleichen Fußballen Injektion, die zuvor BCG empfangen und dann die Trockenlegung pLN 24 Stunden Isolierung später die Anwesenheit von CFSE-markierten Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Obwohl nicht in dem Protokoll beschrieben, LNs von dieser Einrichtung kann auch für die Analyse durch konfokale Mikroskopie vorbereitet werden, Migrationsprozesse wie beispielsweise die Positionierung von wandernd Zellen in der LN ³ zu studieren. Des Weiteren ähnliche Ergebnisse auf BCG ausgelöste Haut DC Migration wurden mit beiden BCG Pasteur 1173P2 ³ und BCG SSI 1331 ¹⁴ erhalten.

CFSE wird üblicherweise zur Kennzeichnung Zellen in vitro und zu verfolgen , wie zum markierten Zellen in vivo nach dem Zelltransfer ¹⁵ verwendet. Obwohl im aktuellen Protokoll wurde verwendet , um direkt die Hautzellen in situ bezeichnen. Die molekulare Basis von CFSE Markierung ist ähnlich FITC, die auch eine aminreaktive Fluoreszenzfarbstoff ist. CFSE wird aber über FITC für die Konjugation bevorzugt, da es creAtes sehr stabile carboxamid Bindungen ^16. Außerdem ist CFSE hoch permeable Membran und diffundiert passiv in die Zellen. Einmal drinnen, bildet sie intrazelluläre Amin (fluoreszierend) Konjugate , die ¹⁵ in der markierten Zelle zurückgehalten werden.

Die CFSE-basierte Migrationstest von den Autoren entwickelte ermöglicht die Identifizierung von Zellen von der Haut zu DLN innerhalb einer 24-Stunden-Periode in Reaktion auf BCG verlagern. Er misst somit acute Migration während eines definierten Zeitrahmen und ermöglicht es, die Fähigkeit verschiedener, zu untersuchen, injiziert Stimuli Migration zu triggern. Dieser Test unterscheidet sich von der klassischen Technik der FITC Hautmalerei, die eine kumulative Migration Ereignis durch kutane topische Anwendung eines berührungsSensibilisierungsMittels ausgelöst misst. Somit kann der CFSE-basierte Migrationstest eingesetzt werden wandernde Haut DCs oder anderen Zellen zu identifizieren, die Heimat der pLN nach der Injektion von Mikroben, mikrobielle Produkte oder andere entzündliche Reize in der footpad. Tatsächlich beide Neutrophilen und γ: δ haben T – Zellen wurden von der Haut zu DLN als Reaktion auf BCG ^17,18 zu verlagern gezeigt. In der Tat wurde der Test vor kurzem in einer Co-Infektion Einstellung , um zu zeigen , dass ein gut-lokalisierte Nematodeninfektion BCG ausgelöste Haut DC Migration auf DLN ¹⁴ stumm schalten können.

DC Migration wird häufig zwischen 24 bis 72 h in FITC Hautauftragung da FITC-markiertem DCs sind schwer zu erkennen 4 bis 5 Tage nach dem Lackieren ¹⁹ beurteilt. Der Verlust des CFSE Signal an gekennzeichneten DCs ist nicht ein Problem in dem Test hier dargestellt, da Analyse der Migration auf 24 Stunden beschränkt wurde; der Grund dafür ist, dass die Autoren "über Nacht" Migrationen gezielt studieren wollte. Andere interessiert in diesem Test werden jedoch ermutigt, früher oder später Zeitpunkte für CFSE-basierten Tracking zu untersuchen. Da darüber hinaus CFSE durch Injektion eingeführt wird, kann es jeder definierten Zeit gegeben werden. Diese Flexibilität erlaubt, die eineuthors DC Migration zwischen Tag zu beurteilen 5 und 6 nach der BCG – Infektion (2C) ^3. Injecting CFSE könnte möglicherweise die Zelltypen zugänglich in situ auf der Markierungsreaktion begrenzen. Beispielsweise Langerhans – Zellen (LCs), die DCs, die in der obersten Schicht der Haut befinden, wandern die Epidermis, schlecht in Reaktion auf BCG in der CFSE-basierte Migrationstest (Abbildung 3) ^3. Doch während FITC Haut malen, positioniert DCs in der Dermis, die Schicht unter der Epidermis, sind leicht beschriftet und auf den DLN schneller als LCs ^20,21 migrieren. Dies legt nahe, dass Zellen Fluorochrom-markierten ohne notwendigerweise benötigt werden, kann auf die Schicht der Haut zu lokalisieren, wo die Markierungslösung aufgebracht wird.

Als Modell für BCG – Infektion bietet die Maus Ohr eine bona fide intradermal der Impfung , die mit der klinischen Anwendung von BCG als Tuberkulose – Impfstoff mehr im Einklang ist. foOtpad Einspritzung auf der anderen Seite, ist wahrscheinlich eine Kombination der intradermale und subkutane Wege. Das heißt, es erfordert Geschick und Training korrekt und reproduzierbar BCG in die Dermis liefern ^22, so in der klinischen Praxis ist es nicht immer wirklich intradermal verabreicht werden kann , sondern subkutanen oder eine Kombination von beiden. Als Impfstelle hat die Fußballen zwei sehr deutliche Vorteile gegenüber dem Ohr haben, die zu erwähnen Verdienst. Zuerst wird die Immunantwort auf das Ablaufen pLN konzentriert nach einer Fußballeninjektion und dies erleichtert die Prüfung der Antworten. Die Autoren dieses Berichts die pLN die erste und wichtigste LN Ablassen der Fußballen ³ zu sein. Andere haben nach der Injektion von Evan-Blau ²³ geteilte Drainage zwischen den Kniekehlen und subiliac LNs vorgeschlagen. Dennoch in Bezug auf das Ohr, gibt es mehr als ein Ohr DLN in Mäusen und diese möglicherweise nicht regelmäßig vorhanden oder einfach ²⁴ zu lokalisieren. Letztere stellt eindeutig eine liability in Studien der Suche nach Antworten in DLN zu untersuchen. (- 50 & mgr; l 10) gegenüber dem Ohr Zweitens können größere Mengen in den Fußballen inokuliert werden. Dies wiederum minimiert sowohl die Haftung der großen Veränderungen in den Lymphfluss der Einführung und des Habens mit sehr kleinen Injektionsvolumina zu arbeiten, die an sich ist ein Problem, wenn es um Impfen große Mengen von Mykobakterien kommt. Im Ohr, wo die Injektionsvolumina klein (1-10 ul) zu sein, auch 5 ul kann Lymphfluss verändern und möglicherweise eine größere Menge des injizierten Materials zwingen, direkt in den DLN in unkontrollierter Weise. Es ist daher wichtig für Injektionsvolumina zu berücksichtigen. Dies ist besonders wichtig bei Versuchen, den Beitrag der Zellen in Überführung Bakterien an der LN-Adressierung. Im BCG Fußballen Modell haben einige BCG kann die DLN in Abwesenheit von zellulären Transport erreicht. Dies basiert auf der Beobachtung, dass eine BCG noch erkennen kann, in der DLN von Mäusen, wo die Zellmigration vom FußKissen wurde durch lokale Injektion von Pertussis – Toxin ³ vollständig abgetragen. Ob dies ein Hinweis darauf, dass BCG direkt Lymphgefäße zugreifen können und die DLN in einer wirklich zellfreie Weise erreichen noch bestimmt werden, da sie nicht, dass Mykobakterien in diesem Fall ausgeschlossen werden kann, wo durch die Kraft des eingespritzten Volumens Zugang zu Lymphgefäße gegeben.

Eine praktische Überlegung für Immunisierungen im Ohr oder Fußballen ist, dass die Tiere ausreichend immobilisiert werden müssen für Injektionszwecke korrekt und in einer reproduzierbaren Art und Weise durchgeführt werden. Isofluran Gas wird in dem aktuellen Protokoll als ein Verfahren zu beschränken Tiere in Vorbereitung für Injektionen Fußballen beschrieben. Die relativ schnelle Induktion und Wiederherstellungszeiten für Isofluran-vermittelte Anästhesie machen es eine beliebte Methode, aber ähnlich wie bei anderen Anästhetika, es wirkt sich die Physiologie, die ²⁵ mit den experimentellen Ergebnissen stören können. Tatsächlich sowohl flüchtige als auch injizierbare Anästhetika verringern Lymphfluss durch die Abschaffungfreiwillige Muskelbewegungen, Muskeltonus zu reduzieren und abnehm Lymphangion Kontraktion ^26. Weiterhin ist eine 5-fache Verringerung der Migration von DLN DCs adoptiv in den Fußballen übertragen hat in narkotisierten Tieren ²⁷ berichtet. In Anbetracht der obigen, und da die Handhabung Verfahren vor der Anästhesie sind wahrscheinlich mehr Stress für die Tiere zu verursachen als die Injektion selbst, die sowohl schnell zu verwalten ist und keine Wiederherstellungsschritt erfordern, hemmen die Möglichkeit, ausreichend um das Tier ohne Betäubung sollten in Betracht gezogen werden. Eine Maus Verzögerer für Fußballen Injektionen besonders angefertigt, in dem das Tier schnell an eine immobilisierte Position und geimpft in den Fußballen innerhalb von 30 bis 40 sec gebracht werden Ideal wäre die Maus in die hinteren Fußballen zu injizieren, ohne andere Aspekte ihrer Physiologie in den Prozess zu verändern und wäre äußerst nützlich in Studien, in denen die Zellmigration durch Lymphgefäße sein.

Abschließend dieser Berichthebt ein neuartiges Protokoll Haut DCs während ihrer Mobilisierung der DLN anhand eines Tests, die Migration während einer definierten 24-Stunden-Fenster überwacht für die Verfolgung. Diese CFSE-basierte Migrationstest ermöglicht die Erkennung und Analyse von Migrationszellen durch Durchflusszytometrie, wie hier detailliert, sowie durch konfokale Mikroskopie ^3. Es bietet eine flexible Plattform für eine Vielzahl von injizierten Stimuli zu studieren und ihre Fähigkeit, DC Migration auslösen, und vor allem, können eingesetzt werden, nicht nur DCs zu verfolgen, sondern auch andere Populationen von der Haut zu DLN während der verschiedenen experimentellen Bedingungen zu bewegen.