Un test basé CFSE pour étudier la migration de la peau murine cellules dendritiques dans les ganglions lymphatiques de drainage lors de l'infection avec<em> Mycobacterium bovis</em> Bacille Calmette-Guérin

CNDO sont des cellules présentatrices d'antigènes spécialisés qui peuvent répondre aux défis microbienne à la surface du corps par l'acquisition de l'antigène microbien et la migration vers DLN via lymphatics. Là, DCs présentent cet antigène aux lymphocytes T d'une manière qui entraîne des réponses des cellules T primaires. Le processus de migration DC à partir du tissu à DLN est donc très important pour comprendre comment une réponse productive des cellules T est lancée. Les méthodes pour mesurer la migration DC sont par conséquent très utiles dans le déroulement ci-dessus.

Un modèle de souris a été utilisé pour étudier la peau migration DC à DLN après l'infection par le BCG, un vaccin vivant qui est injecté dans la peau cliniquement. En ligne, le BCG est injecté dans la patte arrière pour imiter cette voie cutanée de vaccination. Un test simple a été développé et, par conséquent incorporé à ce modèle pour étudier la migration de la peau DC sous-populations à partir du site d'inoculation BCG dans la peau du coussinet plantaire à l'pLN de drainage. Ce protocole relies sur l'injection du CFSE fluorochrome dans le même coussinet plantaire qui, auparavant, a reçu le BCG, puis l'isolement de la vidange pLN 24 h plus tard pour analyser la présence de cellules marquées au CFSE par cytométrie en flux. Bien que non décrite dans le protocole, NLs de cette configuration peuvent également être préparés pour l' analyse par microscopie confocale, pour étudier les processus de migration tels que le positionnement des cellules migratrices dans la LN ^3. En outre, des résultats similaires sur la peau BCG déclenchée par la migration DC ont été obtenus en utilisant à la fois le BCG Pasteur 1173P2 ³ et BCG SSI 1331 ^14.

CFSE est couramment utilisé pour étiqueter des cellules in vitro et de suivre ces cellules marquées in vivo après transferts cellulaires ^15. Dans le protocole actuel cependant, il a été utilisé pour marquer directement les cellules de la peau in situ. La base moléculaire de l'étiquetage CFSE est similaire à FITC, qui est aussi un colorant fluorescent, une amine réactive. CFSE est cependant préférable à FITC pour la conjugaison comme il creAtes bonds carboxamide très stables ^16. En outre, CFSE est très perméable et diffuse passivement dans les cellules. A l' intérieur, il forme une amine intracellulaire (fluorescente) des conjugués qui sont conservés dans la cellule ¹⁵ marquée.

Le test de migration basée CFSE-développé par les auteurs permet l'identification des cellules de la peau à la relocalisation DLN dans un délai de 24 heures en réponse au BCG. Il mesure ainsi la migration aiguë pendant un laps de temps défini et permet d'étudier la capacité des différents, injecté stimuli pour déclencher la migration. Ce dosage est différent de la technique classique de FITC peinture de la peau, qui mesure un événement déclenché par la migration cumulative cutanée, l'application topique d'un agent de sensibilisation par contact. Ainsi, l'analyse de migration à base CFSE peut être utilisé pour identifier les contrôleurs de la peau de migration ou d'autres cellules qui abrite le pLN après l'injection des micro-organismes, des produits microbiens ou d'autres stimuli pro-inflammatoires dans le footpad. En effet, les deux neutrophiles et γ: On a montré ô cellules T à déménager de la peau à DLN en réponse au BCG ^17,18. En fait, l'essai a été récemment utilisé dans un cadre de co-infection à montrer qu'une infection par les nématodes gut-localisée pourrait couper le BCG déclenché par la peau migration DC à DLN ^14.

Migration DC est souvent évaluée entre 24-72 h dans FITC peinture de la peau depuis FITC PED sont difficiles à détecter 4 à 5 jours après avoir peint ^19. La perte du signal CFSE sur étiqueté DC est pas un problème dans l'analyse présentée ici puisque l'analyse de la migration a été limitée à 24 heures; la raison étant que les auteurs ont voulu étudier spécifiquement "une nuit" événements de migration. D'autres intéressés dans cet essai sont toutefois invitées à rechercher les points précédents ou même plus tard temps pour le suivi basé sur CFSE. En outre, depuis CFSE est introduit par injection, il peut être donné à tout moment défini. Cette flexibilité a permis à l'unuteurs pour évaluer la migration DC entre le jour 5 et 6 après l' infection par le BCG (figure 2C) ^3. Injecter CFSE pourrait limiter les types accessibles in situ pour la réaction de marquage des cellules. Pour les cellules de Langerhans instance (LCS), qui sont les CD qui résident dans la couche supérieure de la peau, l'épiderme, migrent peu en réponse au BCG dans l'essai de migration basé sur CFSE (Figure 3) ^3. Cependant, au cours de FITC peinture de la peau, les PED positionnés dans le derme, la couche inférieure de l'épiderme, sont facilement étiquetés et migrent vers le DLN plus rapide que LCS ^20,21. Ceci suggère que les cellules peuvent être marquées au fluorochrome sans avoir nécessairement besoin de localiser à la couche de la peau où la solution de marquage est appliquée.

En tant que modèle pour l' infection par le BCG, l'oreille de la souris fournit une voie intradermique de bonne foi de l' inoculation qui est plus en ligne avec l'administration clinique du BCG comme vaccin contre la tuberculose. foinjection otpad d'autre part, est probablement une combinaison de l'intradermique et sous-cutanée. Cela dit, il exige des compétences et de la formation pour fournir correctement et reproductible BCG dans le derme ^22, dans la pratique clinique , il ne peut pas toujours être donnée véritablement intradermique mais plutôt sous – cutanée ou une combinaison des deux. En tant que site d'inoculation du coussinet plantaire fait avoir deux avantages très clairs sur l'oreille que la mention de mérite. Tout d'abord, la réponse immunitaire est concentrée à l'pLN de drainage après une injection du coussinet plantaire, ce qui facilite l'examen des réponses. Les auteurs de ce rapport ont trouvé la pLN pour être le premier et principal LN drainant la patte ^3. D' autres ont suggéré de drainage partagé entre les poplités et subiliaque NLs après injection de Evan bleu ^23. Néanmoins, en ce qui concerne l'oreille, il y a plus d'une oreille DLN chez la souris et ceux – ci peuvent ne pas être régulièrement présents ou faciles à localiser ^24. Ce dernier présente clairement un liabilité dans les études qui cherchent à enquêter sur les réponses à DLN. D'autre part, des volumes plus importants peuvent être inoculés dans le coussinet plantaire (10-50 ul) par rapport à l'oreille. Ceci à son tour à la fois minimise la responsabilité de l'introduction de modifications importantes dans la circulation lymphatique et d'avoir à travailler avec de très faibles volumes d'injection, ce qui est en elle-même un problème quand il vient à inoculer de grandes quantités de mycobactéries. Dans l'oreille où les volumes d'injection doivent être de petite taille (1-10 pi), même 5 pi peuvent modifier la circulation lymphatique et potentiellement forcer une plus grande quantité de la matière injectée directement dans le DLN de manière incontrôlée. Il est donc important de tenir compte des volumes d'injection. Ceci est particulièrement important dans les expériences portant sur la contribution des cellules dans convoyant des bactéries à LN. Dans le modèle du coussinet plantaire BCG, certains BCG peut avoir atteint le DLN en l'absence de transport cellulaire. Ceci est basé sur l'observation que l'on peut encore détecter le BCG dans le DLN de souris où la migration des cellules du piedpad a été entièrement ablatée par injection locale de la toxine pertussis ^3. Que ce soit une indication que le BCG peut accéder directement à lymphatics et atteindre le DLN d'une manière vraiment exempt de cellules reste à déterminer, car il ne peut pas être exclu que les mycobactéries dans ce cas où donner accès à lymphatics par la force du volume injecté.

Une considération pratique pour les vaccinations dans l'oreille ou capiton plantaire est que les animaux doivent être immobilisés de manière adéquate pour les injections à effectuer correctement et de façon reproductible. gaz isoflurane est décrit dans le protocole actuel comme une méthode pour immobiliser les animaux en cours de préparation pour les injections de footpad. L'induction et de récupération relativement rapide pour l' anesthésie isoflurane médiée font une méthode populaire, mais semblable à d' autres agents anesthésiques, elle affecte la physiologie, qui peuvent interférer avec les résultats expérimentaux ^25. En effet, les anesthésiques volatiles à la fois et injectables diminuent le flux lymphatique en supprimantmouvements musculaires volontaires, ce qui réduit le tonus musculaire, et la diminution des lymphangion contraction ^26. En outre, une réduction de 5 fois la migration vers DLN des PED transfert adoptif dans le coussinet plantaire a été rapportée chez des animaux anesthésiés ^27. Compte tenu de ce qui précède, et étant donné que les procédures de manipulation avant l'anesthésie sont susceptibles de causer plus de stress aux animaux que l'injection elle-même, qui est à la fois rapide à administrer et ne nécessite pas une étape de récupération, la possibilité de restreindre de manière adéquate l'animal sans anesthésie devrait être considéré. Un dispositif de retenue de la souris sur mesure pour les injections footpad, où l'animal peut être rapidement amené à une position immobilisée et on l'inocule dans le coussinet plantaire de 30 à 40 secondes serait idéal pour injecter la souris dans le coussinet plantaire arrière sans altérer d'autres aspects de la physiologie du processus et serait extrêmement utile dans les études portant sur la migration des cellules à travers les vaisseaux lymphatiques.

En conclusion, ce rapportmet en évidence un nouveau protocole pour le suivi des PED de la peau lors de leur mobilisation à l'DLN en utilisant un test qui surveille la migration au cours d'une fenêtre de 24 heures définie. Cet essai de migration sur la base CFSE permet la détection et l' analyse des cellules migratrices par cytométrie de flux, tel que décrit ici, ainsi que par microscopie confocale ^3. Il fournit une plate-forme flexible pour étudier une variété de stimuli injectés et leur capacité à déclencher la migration DC, et surtout, peut être utilisé pour suivre non seulement les CD, mais aussi d'autres populations mobiles de la peau au cours de DLN différents paramètres expérimentaux.