A-CFSE gebaseerde test om de migratie van de huid van muizen dendritische cellen Onderzoek naar drainerende lymfeklieren tijdens infectie met<em> Mycobacterium bovis</em> Bacille Calmette-Guérin

noDCs zijn gespecialiseerde antigen presenterende cellen die kunnen reageren op microbiële op lichaamsoppervlakken door het verwerven microbiële antigenen en migreren naar DLN via lymfevaten. Er DCs presenteren dit antigeen aan T-cellen op een wijze die primaire T-celreacties drijft. De DC migratie van weefsel DLN is derhalve zeer belangrijk om te begrijpen hoe een productieve T-celrespons geïnitieerd. Methoden om DC migratie meten dus zeer nuttig in ontvouwen bovenstaande.

Een muis model werd gebruikt om de huid DC migratie naar DLN na infectie met BCG, een levend vaccin dat klinisch wordt geïnjecteerd in de huid te bestuderen. In lijn, is BCG geïnjecteerd in de achterste voetzool om dit cutane route van vaccinatie na te bootsen. Een eenvoudige test ontwikkeld en derhalve verwerkt dit model om de migratie van de huid DC subpopulaties van BCG inoculatie bij voetzool huid wegvloeien pLN onderzoeken. Dit protocol relies injecteren op het fluorochroom CFSE in dezelfde voetzool die eerder BCG ontvangen en vervolgens het isoleren van het aftappen pLN 24 uur later op de aanwezigheid van CFSE-gelabelde cellen cytometrie geanalyseerd door flow. Hoewel niet in het protocol beschreven, kan LNS van deze opstelling ook worden bereid voor analyse door confocale microscopie, migratie processen te bestuderen zoals de ligging van migrerende cellen in de LN ^3. Bovendien zijn vergelijkbare resultaten op BCG-getriggerd huid DC migratie is verkregen met behulp van zowel BCG Pasteur 1173P2 ³ en BCG SSI 1331 ^14.

CFSE wordt vaak gebruikt om cellen in vitro labelen en dergelijke gelabelde cellen in vivo te volgen nadat cellen ¹⁵ transfers. In het huidige protocol echter, werd het gebruikt om huidcellen direct te labelen in situ. De moleculaire basis van CFSE labeling is vergelijkbaar met FITC, die eveneens een amine-reactieve fluorescerende kleurstof. CFSE heeft echter de voorkeur boven FITC om de vervoeging als het creates zeer stabiele bindingen carboxamide ^16. Bovendien CFSE zeer permeabel membraan en passief diffundeert in cellen. Eenmaal binnen vormt intracellulaire amine (TL) conjugaten die worden vastgehouden in de gelabelde cel ^15.

De CFSE-gebaseerde migratieanalyse ontwikkeld door de auteurs maakt de identificatie van cellen verhuizen van huid DLN binnen een 24-uurs periode in reactie op BCG. Het meet dus acute migratie gedurende een bepaalde periode en maakt het mogelijk om het vermogen van verschillende onderzoeken, geïnjecteerd stimuli migratie veroorzaken. Deze test verschilt van de klassieke techniek van FITC huidstudies, die een cumulatieve migratie gebeurtenis veroorzaakt door cutane, topicale contact sensibiliserend middel meet. Aldus kan de CFSE-gebaseerde assay migratie worden gebruikt om trekkende huid DCs of andere cellen die de thuisbasis van de pLN na de injectie van microben, microbiële of andere inflammatoire stimuli in de F identificerenootpad. Inderdaad, zowel neutrofielen en γ: δ T-cellen hebben aangetoond dat het verplaatsen van huid DLN als reactie op BCG ^17,18. In feite werd de bepaling recent gebruikte in een co-infectie instelling om aan te tonen dat een darm gelokaliseerde nematodeninfectie BCG-getriggerd huid DC migratie kan dempen tot DLN ^14.

DC migratie wordt vaak bepaald tussen 24 tot 72 uur bij FITC huidstudies aangezien FITC-gelabelde DCs moeilijk is om 4 tot 5 dagen na het schilderen ^19. Verlies van de CFSE signaal op het label DC is niet een probleem in de test hier gepresenteerde sinds analyse van de migratie werd beperkt tot 24 uur; De reden hierachter is dat de auteurs wilden specifiek studeren "overnight" migratie evenementen. Anderen die geïnteresseerd zijn in deze test worden echter aangemoedigd om eerder of zelfs latere tijdstippen voor CFSE-based tracking onderzoeken. Aangezien CFSE geïntroduceerd door injectie kan worden toegediend op elk bepaalde tijd. Deze flexibiliteit mag het eenuthors naar DC migratie tussen dag 5 en 6 na BCG infectie (figuur 2C) ³ te beoordelen. Injecteren CFSE zou kunnen beperken de celtypen toegankelijk in situ de labelingsreactie. Bijvoorbeeld Langerhans cellen (LC), die DCs die op de bovenste laag van de huid bevinden zijn, de epidermis, migreren slecht in reactie op BCG in de CFSE-gebaseerde assay migratie (figuur 3) ^3. Tijdens FITC huidstudies, DCs gelegen in de dermis, de laag onder de epidermis, kunnen gemakkelijk gelabeld en migreren naar de DLN sneller dan LCs ^20,21. Dit suggereert dat cellen fluorochroom-gemerkt kan worden zonder het noodzakelijkerwijs te lokaliseren om de laag van de huid waar de labelingoplossing wordt toegepast.

Als model voor BCG-infectie, de muis oor biedt een bona fide intradermale route van inoculatie die meer in lijn met de klinische toediening van BCG als een tuberculose-vaccin. footpad injectie anderzijds, is waarschijnlijk een combinatie van de intradermale en subcutane routes. Dat gezegd hebbende, vereist vaardigheid en training correct en reproduceerbaar leveren BCG de dermis ^22, dus in de klinische praktijk niet altijd worden gespeeld intradermale gegeven maar subcutaan of een combinatie van beide. Als een inenting site van de voetzool heeft wel twee zeer duidelijke voordelen ten opzichte van het oor die verdienste vermelden. Eerst wordt de immuunrespons geconcentreerd wegvloeien pLN na een voetzool injectie en dit vergemakkelijkt het onderzoek van de reacties. De auteurs van dit rapport vond de pLN de eerste en belangrijkste LN aftappen van de voetzool ³ zijn. Anderen hebben split drainage tussen de knieholte en subiliac LNS stelde na injectie van Evan's blue ^23. Niettemin met betrekking tot het oor, is er meer dan één oor DLN bij muizen en deze kunnen niet regelmatig aanwezig of ²⁴ gemakkelijk te vinden zijn. Laatstgenoemde introduceert duidelijk een liabiliteit in studies op zoek naar antwoorden in DLN onderzoeken. Ten tweede, kunnen grotere volumes worden geïnoculeerd in de voetzool (10-50 pl) vergeleken met het oor. Dit op zijn beurt zowel minimaliseert de aansprakelijkheid van de invoering van de belangrijkste veranderingen in lymfatische flow en van het hebben om te werken met zeer kleine injectie volumes, dat is op zich al een probleem als het gaat om het enten van grote hoeveelheden mycobacteriën. In het oor bij injectievolume kleine (1-10 pi) worden, zelfs 5 pl lymfestroom veranderen en mogelijk een grotere hoeveelheid van het geïnjecteerde materiaal dwingen rechtstreeks in de DLN op een ongecontroleerde wijze. Daarom is het belangrijk om rekening te houden injectievolume. Dit is vooral belangrijk in proeven omtrent de bijdrage van cellen in ferrying bacteriën aan de LN. In de BCG voetzool model, kunnen sommige BCG de DLN in afwezigheid van cellulaire transport bereikt. Dit is gebaseerd op de waarneming dat men nog BCG kan detecteren in de DLN muizen waarin celmigratie van de voetpad werd volledig teniet gedaan door de lokale injectie van pertussis toxine ^3. Of dit een indicatie dat BCG direct lymfevaten toegang en bereiken de DLN in een echt celvrije wijze te bepalen aangezien niet kan worden uitgesloten dat mycobacteriën blijft in dit geval toegang krijgen tot lymfevaten met geweld van het geïnjecteerde volume.

Een praktische overweging voor inentingen in het oor of voetzool is dat dieren dienen adequaat te worden geïmmobiliseerd voor injecties correct en op een reproduceerbare wijze worden uitgevoerd. Isofluraan gas wordt in de huidige protocol als methode om dieren te beperken ter voorbereiding voetkusseninjecties. De relatief snelle inductie en herstel tijden voor isofluraan gemedieerde anesthesie maken het een populaire methode, maar vergelijkbaar met andere anesthetica, het beïnvloedt de fysiologie, die kunnen interfereren met experimentele resultaten ^25. Sterker nog, zowel vluchtige en injecteerbare anesthetica verminderen lymfestroom door het afschaffenvrijwillige spierbewegingen, het verminderen van spierspanning, en het verminderen van lymfangion contractie ^26. Bovendien is een 5-voudige verlaging van migratie naar DLN van DCs adoptief overgedragen in de voetzool gerapporteerd bij geanesthetiseerde dieren ^27. Gezien het bovenstaande en aangezien de afhandelingsprocedures voor de anesthesie waarschijnlijk meer stress bij de dieren dan de injectie zelf, die zowel snel te beheren en geen recuperatiestap vereisen, de mogelijkheid om adequaat beperken de dieren zonder verdoving moet beschouwd. Een muis weerhouder aangepast voor voetkusseninjecties, waar het dier kan snel een geïmmobiliseerd positie in de voetzool binnen 30 tot 40 seconden gebracht en geënt zou ideaal zijn om de muis in de voetzool injecteren zonder dat andere aspecten van de fysiologie in de werkwijze en zou zeer nuttig zijn in onderzoeken naar cel migratie door lymphatics zijn.

Kortom, dit verslagwijst op een nieuw protocol voor het bijhouden van de huid DCs tijdens hun mobilisatie aan de DLN gebruik van een test dat migratie controleert gedurende een bepaalde 24-uur-venster. Deze CFSE assay gebaseerd migratie maakt detectie en analyse van migrerende cellen door flowcytometrie, zoals hier beschreven, en door confocale microscopie ^3. Het biedt een flexibel platform voor het bestuderen van diverse stimuli geïnjecteerd en hun vermogen om DC migratie veroorzaken, en belangrijker, kan worden gebruikt om niet alleen DCs ook andere populaties verplaatsen van huid DLN in verschillende experimentele instellingen volgen.