Araştırma yöntemleri<em> B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak> Biyofilmler
Summary
This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.
Abstract
This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.
Introduction
Çok hücresel bakteri toplulukları doğal ve antropojenik ortamlarda önemli rol oynarlar ve yararlı ya da son derece zararlı olabilir. Bu çok hücreli koloniler tek tek hücreler, kendi kendine üretilmiş hücre dışı polimerik maddeler (EPS) matrisi içinde gömülü olup, burada biyofilm, şekilde bilinmektedir. EPS kuvvetle onlar kolonize yüzeye hücreleri yapışır. Bunlar mekanik ve kimyasal güçlerine karşı bir kalkan görevi ve hücresel haberleşme 1 kolaylaştırılması, komşu hücreler arasındaki yakın teması oluşturun. Bir biyofilm hücreleri son derece düzenlenir kullanın farklılaştırılmış topluluk olarak görülebilir, türler 2-5 genelinde yanı sıra, toplum içinde kendi faaliyetlerini koordine etmek süreçlerini düzenledi. Bir biyofilm durumuna büyüme planktonik, serbest yaşayan modundan geçiş genellikle gelişim süreçleri ile ilişkilidir. Bunun iyi bir örneği, Gram-pozitif toprak bakterisi Bacillus subtilis, ve bu nedenle undome olansticated gerilme biyofilm oluşumuna yol açan gelişim aşamalarını incelemek için sağlam bir model organizma olarak hizmet vermektedir. Bu bakteride, hareketli hücreler özel görevleri 4 yürütmek göze çarpan çok hücreli yapılara kendilerini organize. Hücre bir grup, matriks-üretici eksopolisakaridleri 6 salgılar amiloid protein tasa 7,8 ve yüzey hidrofobisite proteini BslA 9,10; bütün bunlar EPS 11-13 montajı katılırlar.
Doğal ve insan kaynaklı nişler biyofilm bolluğu ve yol açabilir varsayılan ölümcül hasar göz önüne alındığında, onların oluşumunu önlemek için yollar bulmak için acil bir ihtiyaç vardır. Küçük molekül inhibitörleri yeni düzenleyici yollar, enzimler ve biyofilm oluşumunda rol oynayan yapısal proteinlerin keşfi yardımcı ve böylece çok hücreli topluluk montaj karmaşık süreçlerde anlayışlar teşvik edebilir. B. de subtilis bio için iyi çalışılmış bir modeldirfilm formasyonu 14,15, çeşitli biyofilm inhibitörlerinin etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu çalışma, küçük molekül inhibitörleri ile biyofilm verilen yanıtın değerlendirilmesi için önemli olan dört temel yöntemler ele almaktadır. İlk olarak, bu inhibitörler, bir biyofilm belirli bir hedef sahip olmasını sağlamak için, biyofilm oluşumunu etkisi planktonik büyüme üzerindeki etkisinin ayrılması önemlidir. Çoğu antibakteriyel ajanlar planktonik büyüme fazında hücreleri hedef, ancak biyofilm yaşam tarzı hedef moleküller nadirdir. Planktonik büyümeyi etkilemeyen moleküller toksik değildir Buna ek olarak, antibiyotik dirençli mutantlar 16 lehine seçici basıncı azaltabilir. Biyofilmler, D-amino asitler ya da diğer bazı hücre duvarı etkileşmeyen molekülleri ile muamele edilir, örneğin, bu da rahatsız veya sökülmesi, fakat bu önleyicilerin sadece hafif planktonik büyüme 12,17 etkiler. Bunun aksine, çok sayıda antibiyotik önemli ölçüde l, planktonik büyümesini bozanittle veya biyofilm oluşumu 17 üzerinde hiçbir etkisi.
İkincisi, küçük moleküllerin etkisini araştırmak için tutarlı ve sağlam deneysel çerçevenin oluşturulması çok önemlidir. Bu küçük moleküllü önleyicilerinin etkin bir konsantrasyon aralığı ön kültür koşulları, bu küçük molekül inhibitörlerinin etkisini incelemek için kullanılan deney düzeneği duyarlı olduğu görülmektedir. Özellikle B. okuyan çeşitli raporlar, Kayan bakteriyel biyofilm 12,17-19 – subtilis D-amino asitler ince zarlar oluşumunu inhibe eden konsantrasyon aralığında varyasyonlar ortaya koymuştur. Burada sunulan sonuçlar, aşağıdaki faktörler aktif madde konsantrasyonu aralığı içinde farklılıkları hesaba işaret etmektedir: ön-kültür koşulları (geç durağan 20 büyüme fazının karşı logaritmik 12,17), ön-kültür durumda kullanılan büyüme ortamı (zengin, tanımlanan karşı tanımsız [Luria Broth LB] [monosodyum glutamatgliserol, MSgg]), aşılama oranı ve aşılamadan önce ön-kültür ortamı, özellikle çıkarılması. Statik zar büyüme sıcaklığı küçük molekül inhibitörü, D-lösin, bu çalışmada kullanılan Örnek D-amino asit aktivitesi aralığında daha az önemli bir rol göstermiştir.
Son olarak, bir kez biyofilm belirli bir biyofilm önleyicileri, sağlam ve bilgilendirici yöntemler biyofilm uygunluk bu inhibitörlerinin etkilerini karakterize etmek için gerekli olan ile muamele edilir. Bir biyofilm koloni ve antimikrobiyal ajanlara karşı direnç tek hücre (1) üzerine etki: Burada, bağımsız bir şekilde, küçük moleküllü inhibitörlerinin etkisini karakterize etmek için iki yöntem ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Serbest yaşayan bakteriler 21-23 kıyasla Biyofilmlererde Hücreler genellikle daha dirençli antibiyotiklere vardır. Bu olgu çok faktörlü olmasına rağmen, antibiyotik penetrasyon azaltmak için EPS yeteneği genellikle çekici bir açıklama 24 olarak kabul edildi </sus>. Bu yöntem, anti-bakteriyel maddelerin maruz kaldıktan sonra önceden belirlenmiş biyofilm hücrelerinin hayatta kalma değerlendirir. (2) küçük çapta büyük gelen biyofilm koloni mimarisi üzerindeki etkisi. Biyofilm koloniler üç boyutlu yapısı ve EPS varlığı ile karakterize edilir. taramalı elektron mikroskobu kullanarak, hücre morfolojisi, biyofilm koloni yapısı ve EPS mimari ve bolluk içinde değişiklikler küçük ölçekli (um) büyük (mm) den görüntülenebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bacillus subtilis formları sağlam ve son derece yapılandırılmış biyofilm hem sıvıda (zarlarına) ve katı ortamda (koloni). Bu nedenle, belirli biyofilm inhibitörlerinin etki moduna karakterize için ideal bir model organizma olarak hizmet vermektedir. Katı ortam üzerinde, hücreler merkezden kenara doğru yayılan kırışıklıkları gibi ince zarlar belirgin olmayan ayırt edici özellikleri ile çok hücreli yapılar oluşturur. Bu nedenle, ince zarlar ve koloniler B çalışma tamamlay…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation – Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.
Materials
| Luria Broth, Lennox | Difco | 240230 | |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G | |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Fisher Scientific, 209.27 g/mol | BP308-500 | |
| magnesium chloride hexahydrate | Merck, 203.30 g/mol | 1.05833.0250 | |
| calcium chloride anhydrous | J.T. Baker, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
| manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
| iron(III) chloride hexahydrate | Sigma, 270.30 g/mo) | F2877-500G | |
| zinc chloride anhydrous | Acros Organics, 136.29 g/mol | 424592500 | |
| thiamine hydrochloride | Sigma, 337.27 g/mol | T1270-100G | |
| L-tryptophan | Fisher Scientific, 204.1 g/mol | BP395-100 | |
| L-phenylalanine | Sigma, 165.19 g/mol | P5482-100G | |
| L-threonine | Sigma, 119.12 g/mol | T8625-100G | |
| glycerol anhydrous | Bio-Lab Itd | 712022300 | |
| L-glutamic acid monosodium salts hydrate | Sigma, 169.11 g/mol | G1626-1KG | |
| D-leucine | Sigma, 169.11 g/mol | 855448-10G | |
| ethanol anhydrous | Gadot | 830000054 | |
| razor blade | Eddison | NA | |
| circular cellulose filter papers | Whatman, 90 mm | 1001-090 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water | 16220 | |
| paraformaldehyde | EMS, 16% in water | 15710 | |
| sodium cacodylate | Merck, 214.05 g/mol | 8.2067 | |
| calcium chloride 2-hydrate | Merck, 147.02 g/mol | 1172113 | |
| stub-aluminium mount | EMS, sloted head | 75230 | |
| carbon adhesive tape | EMS | 77825-12 | |
| Shaker 37°C | New Brunswick Scientific Innowa42 | NA | |
| Centrifuge | Eppendorf table top centrifuge 5424 | NA | |
| Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip | Branson | NA | |
| Incubator 30 °C | Binder | NA | |
| Incubator 23 °C | Binder | NA | |
| Filter System, 500 ml, polystyrene | Cornig Incorporated | NA | |
| Rotary Shaker – Orbitron Rotatory II | Boekel | NA | |
| S150 Sputter Coater | Edwards | NA | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | NA | |
| Environmental Scanning Electron Microscope | XL30 ESEM FEG Philips (FEI) | NA |
References
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annu Rev Microbiol. 56, 187-209 (2002).
- Miller, M. B., Bassler, B. L. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol. 55, 165-199 (2001).
- Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism. Curr Opin Microbiol. 10, 638-643 (2007).
- Kolter, R., Greenberg, E. P. Microbial sciences: the superficial life of microbes. Nature. 441, 300-302 (2006).
- Kearns, D. B., Chu, F., Branda, S. S., Kolter, R., Losick, R. A master regulator for biofilm formation by Bacillus subtilis. Mol Microbiol. 55, 739-749 (2005).
- Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
- Romero, D., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Amyloid fibers provide structural integrity to Bacillus subtilis biofilms. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 2230-2234 (2010).
- Kobayashi, K., Iwano, M. BslA(YuaB) forms a hydrophobic layer on the surface of Bacillus subtilis biofilms. Mol Microbiol. 85, 51-66 (2012).
- Hobley, L., et al. BslA is a self-assembling bacterial hydrophobin that coats the Bacillus subtilis biofilm. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 13600-13605 (2013).
- Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms. Mol Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).
- Kolodkin-Gal, I., et al. D-amino acids trigger biofilm disassembly. Science. 328, 627-629 (2010).
- Chan, Y. G., Kim, H. K., Schneewind, O., Missiakas, D. The capsular polysaccharide of Staphylococcus aureus is attached to peptidoglycan by the LytR-CpsA-Psr (LCP) family of enzymes. J Biol Chem. 289, 15680-15690 (2014).
- Mielich-Suss, B., Lopez, D. Molecular mechanisms involved in Bacillus subtilis biofilm formation. Environ Microbiol. 17, 555-565 (2014).
- Cairns, L. S., Hobley, L., Stanley-Wall, N. R. Biofilm formation by Bacillus subtilis: new insights into regulatory strategies and assembly mechanisms. Mol Microbiol. 93, 587-598 (2014).
- Chen, M., Yu, Q., Sun, H. Novel strategies for the prevention and treatment of biofilm related infections. Int J Mol Sci. 14, 18488-18501 (2013).
- Bucher, T., Oppenheimer-Shaanan, Y., Savidor, A., Bloom-Ackermann, Z., Kolodkin-Gal, I. Disturbance of the bacterial cell wall specifically interferes with biofilm formation. Environ Microbiol Rep. 7, 990-1004 (2015).
- Sarkar, S., Pires, M. M. D-Amino acids do not inhibit biofilm formation in Staphylococcus aureus. PLoS One. 10, e0117613 (2015).
- Wei, W., Bing, W., Ren, J., Qu, X. Near infrared-caged D-amino acids multifunctional assembly for simultaneously eradicating biofilms and bacteria. Chem Commun (Camb). 51, 12677-12679 (2015).
- Leiman, S. A., et al. D-amino acids indirectly inhibit biofilm formation in Bacillus subtilis by interfering with protein synthesis. J Bacteriol. 195, 5391-5395 (2013).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Davies, D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov. 2, 114-122 (2003).
- Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 877-886 (2015).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15, 2865-2878 (2013).
- Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 11621-11626 (2001).
- Holscher, T., et al. Motility, Chemotaxis and Aerotaxis Contribute to Competitiveness during Bacterial Pellicle Biofilm Development. J Mol Biol. 427, 3695-3708 (2015).
- Bray, D. . Methods in Biotechnology. 13, 235-243 (2000).
- Ensikat, H. J., Ditsche-Kuru, P., Barthlott, W. . Scanning electron microscopy of plant surfaces: simple but sophisticated methods for preparation and examination. 1, 248-255 (2010).
- Hayat, M. A. . Principles and techniques of scanning electron microscopy: Biological applications. 2, (1976).
- Schatten, H. . Scanning Electron Microscopy for the Life Sciences. , (2013).
- Bridier, A., Meylheuc, T., Briandet, R. Realistic representation of Bacillus subtilis biofilms architecture using combined microscopy (CLSM, ESEM and FESEM). Micron. 48, 65-69 (2013).
- Boyde, A., MacOnnachie, E. Volume changes during preparation of mouse embryonic tissue for scanning electron microscopy. SCANNING. 2, 149-163 (1979).
- Yao, Z., Kahne, D., Kishony, R. Distinct single-cell morphological dynamics under beta-lactam antibiotics. Mol Cell. 48, 705-712 (2012).
- Epstein, A. K., Pokroy, B., Seminara, A., Aizenberg, J. Bacterial biofilm shows persistent resistance to liquid wetting and gas penetration. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 995-1000 (2011).
- Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11, 157-168 (2013).
- Shemesh, M., Chai, Y. A combination of glycerol and manganese promotes biofilm formation in Bacillus subtilis via histidine kinase KinD signaling. J Bacteriol. 195, 2747-2754 (2013).
- Kolodkin-Gal, I., et al. Respiration control of multicellularity in Bacillus subtilis by a complex of the cytochrome chain with a membrane-embedded histidine kinase. Genes Dev. 27, 887-899 (2013).
- Oppenheimer-Shaanan, Y., et al. Spatio-temporal assembly of functional mineral scaffolds within microbial biofilms. npj Biofilms and Microbiomes. 2, 15031 (2016).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. , e3796 (2012).
- Bogino, P. C., Oliva Mde, L., Sorroche, F. G., Giordano, W. The role of bacterial biofilms and surface components in plant-bacterial associations. Int J Mol Sci. 14, 15838-15859 (2013).
- Fratamico, P. M., Annous, B. A., Guenther, N. W. . Biofilms in the Food and Beverage Industires. 1, (2009).
- Gao, G., et al. Effect of biocontrol agent Pseudomonas fluorescens 2P24 on soil fungal community in cucumber rhizosphere using T-RFLP and DGGE. PLoS One. 7, e31806 (2012).
- Chen, Y., et al. Biocontrol of tomato wilt disease by Bacillus subtilis isolates from natural environments depends on conserved genes mediating biofilm formation. Environ Microbiol. 15, 848-864 (2013).
- Bryers, J. D. Medical biofilms. Biotechnol Bioeng. 100, 1-18 (2008).
- Logan, B. E. Exoelectrogenic bacteria that power microbial fuel cells. Nat Rev Microbiol. 7, 375-381 (2009).
- Nevin, K. P., Woodard, T. L., Franks, A. E., Summers, Z. M., Lovley, D. R. Microbial electrosynthesis: feeding microbes electricity to convert carbon dioxide and water to multicarbon extracellular organic compounds. MBio. 1, (2010).
- Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol Rev. 34, 3-17 (2010).
- Li, J., Wang, N. Foliar application of biofilm formation-inhibiting compounds enhances control of citrus canker caused by Xanthomonas citri subsp. citri. Phytopathology. 104, 134-142 (2014).
- Okegbe, C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. Redox-driven regulation of microbial community morphogenesis. Curr Opin Microbiol. 18, 39-45 (2014).
- Mann, E. E., Wozniak, D. J. Pseudomonas biofilm matrix composition and niche biology. FEMS Microbiol Rev. 36, 893-916 (2012).
- Bouffartigues, E., et al. Sucrose favors Pseudomonas aeruginosa pellicle production through the extracytoplasmic function sigma factor SigX. FEMS Microbiol Lett. 356, 193-200 (2014).
- Wu, C., Lim, J. Y., Fuller, G. G., Cegelski, L. Quantitative analysis of amyloid-integrated biofilms formed by uropathogenic Escherichia coli at the air-liquid interface. Biophys J. 103, 464-471 (2012).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an Architectural Element in Spatially Structured Escherichia coli Biofilms. J Bacteriol. 195, 5540-5554 (2013).
