Metodologias para o estudo<em> B. subtilis</em> Os biofilmes como um modelo para a caracterização de pequena molécula biofilme Inibidores

comunidades bacterianas multi-celulares desempenham papéis importantes em ambientes naturais e antropogênicas, e pode ser benéfica ou altamente prejudicial. Estas colónias multi-celulares são conhecidos como biofilmes, em que as células individuais são embutidos em um (EPS) de matriz extracelular substâncias poliméricas auto-produzido. Os EPS aderir fortemente as células à superfície, eles colonizam. Eles servem como um escudo contra as forças mecânicas e químicas e criar contacto próximo entre as células vizinhas, facilitando a comunicação celular ^1. Um biofilme pode ser visto como uma comunidade diferenciada, em que as células usam altamente regulado, orquestrada processos para coordenar as suas actividades no seio da comunidade, bem como entre espécies ^2-5. A transição de uma planctônicas, o modo de vida livre do crescimento a um estado de biofilme é frequentemente associada com os processos de desenvolvimento. Um bom exemplo é o Bacillus subtilis bactéria do solo Gram-positivas, e, portanto, uma undomeestirpe sticated serve como um organismo modelo robusto para estudar os estágios de desenvolvimento que conduzem a formação de biofilme. Nesta bactéria, células móveis se organizam em estruturas multicelulares conspícuos que realizam tarefas especializadas ^4. Um grupo de células, a matriz-produtores secretam exopolissacáridos ^6, a proteína amilóide tasa ^7,8, e a proteína de hidrofobicidade da superfície BslA ^9,10; todos os que participam da montagem dos EPS ^11-13.

Dada a abundância de biofilmes em nichos naturais e antrópicos e os danos fatais putativo eles podem causar, há uma necessidade premente de encontrar formas de prevenir a sua formação. inibidores de moléculas pequenas podem auxiliar na descoberta de novas vias reguladoras, enzimas e proteínas estruturais envolvidas na formação de biofilme, e, assim, promover insights os complexos processos de montagem comunidade multicelular. Como B. subtilis é um modelo bem estudado para bioformação de película ^14,15, ele pode ser usado para avaliar os efeitos de vários inibidores de biofilme. Este estudo aborda quatro métodos fundamentais que são a chave para avaliar a resposta de biofilmes a inibidores de pequenas moléculas. Em primeiro lugar, para assegurar que estes inibidores têm um alvo específico do biofilme, a separação do efeito sobre o crescimento planctônicas de o efeito sobre a formação de biofilme é crítica. A maioria dos agentes antibacterianos como alvo as células em sua fase de crescimento planctônicas, mas as moléculas que têm como alvo o estilo de vida biofilme são raros. Além disso, como as moléculas que não afectam o crescimento planctônicas não são tóxicos, podem reduzir a pressão selectiva favorecendo mutantes resistentes a antibióticos ^16. Por exemplo, quando biofilmes são tratados com D-aminoácidos ou determinadas outras moléculas interferentes da parede celular, eles são ou perturbada ou desmontado, mas estes inibidores apenas afectam moderadamente ^12,17 crescimento planctônicas. Em contraste, muitos antibióticos prejudicar drasticamente o crescimento planctônicas, com little ou nenhum efeito sobre a formação de biofilme ^17.

Em segundo lugar, que estabelece um quadro experimental consistente e robusta para estudar o efeito de as moléculas pequenas é crucial. Observou-se que o intervalo de concentração activa de inibidores de moléculas pequenas era sensível às condições de pré-cultura e para a instalação experimental utilizada para estudar o efeito destes inibidores de moléculas pequenas. Vários relatórios, particularmente aqueles que estudam B. subtilis, revelou variações no intervalo de concentrações em que D-aminoácidos inibem a formação de películas – as flutuantes biofilmes bacterianas ^12,17-19. Os resultados aqui apresentados sugerem que os seguintes fatores em conta as diferenças na faixa de concentração ativa: as condições pré-cultura (logarítmica ^12,17 ante fase de ²⁰ crescimento tardio-estacionária), o meio de crescimento utilizada na condição de pré-cultura (rico, indefinido [Caldo de Luria, LB] versus definido [glutamato monossódico-glicerol, MSgg]), a proporção da inoculação e, especialmente, a remoção do meio de pré-cultura antes da inoculação. A temperatura de crescimento da película estática mostrou um papel menos importante na gama do inibidor de molécula pequena de D-leucina, uma D-aminoácido representativa utilizada neste estudo a actividade.

Finalmente, uma vez que os biofilmes são tratados com inibidores específicos de biofilme, métodos robustos e informativas são necessários para caracterizar os efeitos destes inibidores sobre a aptidão do biofilme. Aqui, dois métodos para caracterizar de forma independente do efeito de inibidores de moléculas pequenas são descritos em detalhe: (1) O efeito sobre as células individuais dentro de uma colónia de biofilme e a sua resistência a agentes antimicrobianos. As células em biofilmes são tipicamente mais resistentes a antibióticos quando comparado com as bactérias de vida livre ^21-23. Embora este fenómeno é multifactorial, a capacidade do EPS para reduzir a penetração de antibiótico foi muitas vezes considerado como uma explicação atraente ²⁴ </sup>. Este método avalia a sobrevivência de células do biofilme pré-estabelecido após a exposição a substâncias antibacterianas. (2) O efeito sobre a arquitectura do biofilme colónia, a partir da grande para a pequena escala. colónias de biofilme são caracterizados pela sua estrutura tridimensional e a presença do EPS. Utilizando microscopia eletrônica de varredura, as alterações na morfologia celular, estrutura da colônia de biofilme e a arquitetura e abundância das EPS pode ser visualizado a partir do grande (mm) para a pequena escala (mm).