Metodologie per lo studio<em> B. subtilis</em> I biofilm come modello per Caratterizzare piccole molecole inibitori biofilm

comunità batteriche multi-cellulari giocano un ruolo significativo in ambienti naturali e antropici, e può essere utile o altamente deleterio. Queste colonie multicellulari sono noti come biofilm, in cui le singole celle sono incorporate in una matrice sostanze polimeriche extracellulari autoprodotti (EPS). L'EPS aderiscono fortemente le cellule alla superficie colonizzano. Essi servono come scudo contro le forze meccaniche e chimiche e creano stretto contatto tra cellule vicine, facilitando comunicazione cellulare ^1. Un biofilm può essere visto come una comunità differenziate, in cui le cellule uso altamente regolati, orchestrato processi per coordinare le loro attività all'interno della comunità, così come tra le specie ^2-5. Il passaggio da un planctoniche, modalità di vita libera di crescita a uno stato biofilm è spesso associata a processi di sviluppo. Un buon esempio è il Bacillus subtilis batterio del suolo Gram-positivi, e quindi un undómëceppo sticated serve come un modello robusto organismo per studiare le fasi di sviluppo che portano alla formazione di biofilm. In questo batterio, cellule mobili si organizzano in strutture multicellulari cospicui che svolgono mansioni specializzate ^4. Un gruppo di cellule, la matrice-produttori secernono esopolisaccaridi ^6, la proteina amiloide ATAS ^7,8, e la proteina di superficie hydrophobicity BSLA ^9,10; ognuno dei quali partecipare all'Assemblea degli EPS ^11-13.

Data l'abbondanza di biofilm in nicchie naturali e antropici e il danno fatale putativo possono causare, vi è un urgente bisogno di trovare modi per prevenire la loro formazione. Gli inibitori di piccole molecole in grado di aiutare nella scoperta di nuovi percorsi normativi, enzimi e proteine ​​strutturali coinvolte nella formazione di biofilm, e, quindi, di promuovere approfondimenti nei complessi processi di assemblaggio comunità multicellulare. Come B. subtilis è un modello ben studiato per la biofilmazione ^14,15, può essere utilizzato per valutare gli effetti di vari inibitori biofilm. Questo studio affronta quattro metodi fondamentali che sono fondamentali per la valutazione della risposta dei biofilm a piccole molecole inibitrici. Innanzitutto, per garantire che questi inibitori hanno un obiettivo specifico biofilm, la separazione degli effetti sulla crescita planctonici dall'effetto sulla formazione del biofilm è critica. La maggior parte degli agenti antibatterici colpire le cellule nella loro fase di crescita planctonici, ma le molecole che hanno come target lo stile di vita biofilm sono rari. Inoltre, come le molecole che non influenzano la crescita planctonici non sono tossici, possono ridurre la pressione selettiva che favorisce i mutanti resistenti agli antibiotici ^16. Per esempio, quando biofilm sono trattati con D-amminoacidi o alcune altre molecole parete cellulare interferente, o sono disturbati o smontati, ma questi inibitori riguardano solo lievemente planktonic ^12,17 crescita. Al contrario, molti antibiotici alterano drammaticamente la crescita planctonici, con little o nessun effetto sulla formazione di biofilm ^17.

In secondo luogo, che stabilisce un quadro sperimentale consistente e robusto per studiare l'effetto delle piccole molecole è fondamentale. Abbiamo osservato che l'intervallo di concentrazione attiva delle piccole molecole inibitrici era sensibile alle condizioni pre-coltura e alla configurazione sperimentale utilizzato per studiare l'effetto di queste piccole molecole inibitrici. Diversi rapporti, in particolare quelli che studiano B. subtilis, rivelato variazioni nell'intervallo di concentrazione in cui D-amminoacidi inibiscono la formazione di pellicole – i galleggianti biofilm batterici ^12,17-19. I risultati qui presentati indicano che i seguenti fattori rappresentano differenze nella gamma di concentrazione attiva: le condizioni di pre-coltura (logaritmica ^12,17 contro fase tardo-stazionaria ²⁰ di crescita), il terreno di coltura utilizzato nella condizione di pre-cultura (ricco, indefinita [Luria Broth, LB] contro definito [glutammato monosodico-glycerol, MSgg]), il rapporto di inoculazione e soprattutto la rimozione del mezzo di precoltura prima dell'inoculo. La temperatura di crescita pellicola statica mostrato un ruolo meno importante nella gamma attività della piccola molecola inibitore D-leucina, acido rappresentante D-amino utilizzato in questo studio.

Infine, una volta che i biofilm sono trattati con inibitori biofilm specifici, metodi robusti e informativi sono necessari per caratterizzare gli effetti di questi inibitori sui biofilm fitness. Qui, due metodi per caratterizzare in modo indipendente l'effetto di piccole molecole inibitrici sono descritte in dettaglio: (1) L'effetto sulla singole celle all'interno di una colonia di biofilm e la loro resistenza agli agenti antimicrobici. Le cellule in biofilm sono in genere più resistenti agli antibiotici rispetto ai batteri a vita libera ^21-23. Mentre questo fenomeno è multifattoriale, la capacità dell'EPS per ridurre la penetrazione antibiotico è spesso considerata come una spiegazione attraente ²⁴ </sup>. Questo metodo valuta la sopravvivenza delle cellule biofilm prestabiliti dopo l'esposizione a sostanze antibatteriche. (2) L'effetto sull'architettura biofilm colonia, dalla grande alla piccola scala. colonie Biofilm sono caratterizzati dalla loro struttura tridimensionale e la presenza di EPS. Utilizzando la microscopia elettronica a scansione, cambiamenti nella morfologia cellulare, struttura colonia biofilm e l'architettura e l'abbondanza dei EPS possono essere visualizzati dal grande (mm) alla piccola scala (micron).