Methodologien für das Studium<em> B. subtilis</em> Biofilme als Modell für kleine Molekül-Inhibitoren Biofilm Charakterisieren

Mehrzelligen Bakteriengemeinschaften spielen eine bedeutende Rolle in natürlichen und anthropogenen Umgebungen und kann vorteilhaft oder sehr schädlich sein. Diese mehrzelligen Kolonien werden als Biofilm bekannt ist, wobei die einzelnen Zellen in einer selbst hergestellten extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) Matrix eingebettet sind. Die EPS haften stark die Zellen an der Oberfläche sie besiedeln. Sie dienen als Schutzschild gegen mechanische und chemische Kräfte und schaffen einen engen Kontakt zwischen benachbarten Zellen, die Erleichterung zellulären Kommunikation ^1. Ein Biofilm kann als differenzierte Gemeinschaft betrachtet werden, in denen Zellen stark regulierten verwenden, Prozesse orchestriert ihre Aktivitäten innerhalb der Gemeinschaft zu koordinieren, sowie über Artgrenzen ^2-5. Der Übergang von einer planktonischen, wird freilebenden Modus des Wachstums eines Biofilms Zustand oft mit Entwicklungsprozessen verbunden. Ein gutes Beispiel ist die Gram-positiven Bodenbakteriums Bacillus subtilis, und daher ein undomesticated Stamm dient als robuster Organismus Modell die Entwicklungsstadien, die zu Biofilmbildung zu untersuchen. In diesem Bakterium, sich in auffälliger vielzelligen Strukturen bewegliche Zellen organisieren , die spezielle Aufgaben ⁴ auszuführen. Eine Gruppe von Zellen, die matrix-Erzeuger sekretieren Exopolysaccharide ^6, das Amyloid – Protein tasa ^7,8, und die Oberfläche Hydrophobizität Protein BSLA ^9,10; von denen alle mit bei der Montage der EPS ^11-13.

Angesichts der Fülle von Biofilmen in natürlichen und anthropogenen Nischen und die vermeintliche tödlichen Schaden, den sie verursachen können, gibt es eine dringende Notwendigkeit, Wege zu finden, ihre Bildung zu verhindern. Kleine Molekül-Inhibitoren können in der Entdeckung neuer Regulationswege unterstützen, Enzyme und Struktur der Biofilmbildung beteiligten Proteine ​​und damit fördern Einblicke in die komplexen Prozesse der vielzelligen Gemeindeversammlung. Als B. subtilis ist ein gut untersuchtes Modell für BioFilmbildung ^14,15, kann es verwendet werden , um die Wirkungen verschiedener Biofilm Inhibitoren zu bewerten. Diese Studie befasst sich vier grundlegende Methoden, die für die Bewertung der Reaktion von Biofilmen zu kleinen Molekül-Inhibitoren sind der Schlüssel. Erstens, um sicherzustellen, dass diese Inhibitoren haben einen Biofilm-spezifischen Ziel, die Trennung der planktonischen Wirkung auf das Wachstum von der Wirkung auf die Bildung von Biofilmen ist kritisch. Die meisten antibakterielle Mittel Zielzellen in ihre planktonischen Wachstumsphase, sondern Moleküle, die die Biofilm Lebensstil Ziel sind selten. Zusätzlich kann , wie Moleküle , die nicht toxisch nicht planktonischen Wachstum beeinflussen, können sie den Selektionsdruck begünstigt antibiotische resistente Mutanten ¹⁶ reduzieren. Wenn zum Beispiel Biofilme mit D-Aminosäuren oder bestimmten anderen Zellwand-störenden Molekülen behandelt werden, werden sie entweder gestört oder zerlegt werden , aber diese Inhibitoren leicht nur planktonischen Wachstums ^12,17 beeinflussen. Im Gegensatz dazu beeinträchtigen viele Antibiotika dramatisch Planktonwachstum, mit lenig oder keine Wirkung auf die Bildung von Biofilmen ^17.

Zweitens, eine konsistente und robuste experimentellen Rahmen zur Gründung der Wirkung der kleinen Moleküle zu untersuchen ist von entscheidender Bedeutung. Wir haben beobachtet, dass die aktive Konzentrationsbereich von kleinen Molekül-Inhibitoren war empfindlich auf die Vorkultur Bedingungen und zu den experimentellen Aufbau die Wirkung dieser kleinen Molekül-Inhibitoren zu untersuchen verwendet. Verschiedene Berichte, insbesondere solche B. das Studium subtilis zeigten Variationen in dem Konzentrationsbereich , bei der D-Aminosäuren , die Bildung von Häutchen hemmen – die schwimmenden bakteriellen Biofilmen ^12,17-19. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin , dass die folgenden Faktoren für Unterschiede in der aktiven Konzentrationsbereich ausmachen: Die Vorkultur Bedingungen (logarithmische ^12,17 im Vergleich zu späten stationären Wachstumsphase ^20), das Wachstumsmedium in der Vorkultur Zustand verwendet (reich, undefined [Luria Broth, LB] gegen definiert [Natriumglutamatglycerin, MSgg]), das Verhältnis der Inokulation und insbesondere die Entfernung des Vorkulturmediums vor der Inokulation. Die Temperatur des statischen Pellicle Wachstum zeigten eine weniger wichtige Rolle bei der Aktivitätsbereich des kleinen Molekül-Hemmstoff D-Leucin, einer repräsentativen D-Aminosäure in dieser Studie verwendet.

Schließlich, nachdem die Biofilme mit spezifischen Biofilm-Inhibitoren behandelt, robust und informative Verfahren erforderlich sind, um die Auswirkungen dieser Inhibitoren auf Biofilm Fitness zu charakterisieren. Hier sind zwei Methoden, unabhängig die Wirkung von niedermolekularen Inhibitoren kennzeichnen, sind im einzelnen beschrieben: (1) Die Wirkung auf die einzelnen Zellen innerhalb eines Biofilms Kolonie und ihre Resistenz gegen antimikrobielle Mittel. Die Zellen in Biofilmen sind in der Regel resistent gegen Antibiotika im Vergleich zu den Bakterien freilebenden ^21-23. Während dieses Phänomen multifaktoriell ist, wurde die Fähigkeit der EPS – Antibiotikum Penetration zu reduzieren oft als attraktiver Erklärung ²⁴ betrachtet </sup>. Diese Methode bewertet das Überleben der vorher festgelegten Biofilm-Zellen nach der Exposition gegenüber antibakterielle Substanzen. (2) Die Wirkung auf die Biofilm-Kolonie-Architektur von der großen zur kleinen Maßstab. Biofilm-Kolonien werden durch ihre dreidimensionale Struktur und die Anwesenheit der EPS gekennzeichnet. Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie, Veränderungen in der Zellmorphologie, Biofilm Koloniestruktur und die Architektur und die Abundanz der EPS kann aus der großen (mm) sichtbar gemacht werden, um die kleinen Maßstab (um).