Methodologieën voor het bestuderen<em> B. subtilis</em> Biofilms als een model voor het karakteriseren van Small Molecule biofilminhibitoren

Multi-cellulaire bacteriële gemeenschappen spelen een belangrijke rol in natuurlijke en anthropogene omgevingen, en kan nuttig of zeer schadelijk zijn. Deze meercellige kolonies bekend als biofilms, waarbij de afzonderlijke cellen zijn ingebed in een zelf geproduceerde extracellulaire polymere stoffen (EPS) matrix. De EPS sterk hechten de cellen aan het oppervlak ze koloniseren. Ze dienen als een schild tegen mechanische en chemische krachten en het creëren van nauw contact tussen naburige cellen, cellulaire communicatie ^{1 te} vergemakkelijken. Een biofilm kan worden gezien als een gedifferentieerd gemeenschap, waar de cellen in hoge mate gebruik gereguleerd, georkestreerd processen om hun activiteiten binnen de gemeenschap te coördineren, evenals verschillende diersoorten ^2-5. De overgang van een plankton, vrijlevende modus van de groei van een biofilm toestand wordt vaak geassocieerd met ontwikkelingsprocessen. Een goed voorbeeld is de Gram-positieve bodem bacterie Bacillus subtilis, en dus een undomesticated stam dient als een robuust model organisme om de ontwikkelingsfasen die leiden tot de vorming van biofilm te bestuderen. In deze bacterie, beweeglijke cellen zichzelf te organiseren in het oog springende meercellige structuren die gespecialiseerde taken ⁴ uit te voeren. Een groep cellen, de matrix-producenten uitscheiden exopolysaccharides ^6, het amyloïde proteïne TASA ^7,8 en de oppervlaktehydrofobiciteit eiwit BSLA ^9,10; die allemaal deelnemen aan de vergadering van de EPS ^11-13.

Gezien de overvloed van biofilms in natuurlijke en antropogene niches en de vermeende fatale schade die ze kunnen veroorzaken, is er dringend behoefte aan manieren om hun vorming te voorkomen vinden. Kleinmoleculige remmers kunnen helpen bij het ontdekken van nieuwe regulatorische ketens, enzymen en structurele eiwitten betrokken bij biofilmvorming, en daardoor inzicht in de complexe processen van meercellige Gemeenschapsopbouw promoten. Zoals B. subtilis is een goed bestudeerde model voor biofilmvorming ^14,15, kan het worden gebruikt om de effecten van verschillende biofilminhibitoren beoordelen. Deze studie behandelt vier fundamentele methoden die sleutel voor het evalueren van de respons van biofilms te klein molecuul-remmers zijn. Eerst, zodat deze remmers een biofilm-specifiek doel, de afscheiding van het effect op plankton groei en het effect op biofilmvorming kritisch. De meeste antibacteriële middelen richten op cellen in hun planktonische groeifase, maar moleculen die de biofilm levensstijl richten op zijn zeldzaam. Bovendien, zoals moleculen die geen invloed plankton groei niet toxisch, ze kunnen de selectiedruk begunstiging antibiotica resistente mutanten ¹⁶ verminderen. Wanneer bijvoorbeeld biofilms worden behandeld met D-aminozuren of bepaalde andere celwand storende moleculen, ze ofwel verstoord of gedemonteerd, maar deze inhibitoren slechts licht beïnvloeden planktonische groei ^12,17. Daarentegen veel antibiotica drastisch beïnvloeden plankton groei, aan little of geen effect op biofilmvorming ^17.

Ten tweede, de oprichting van een consistent en robuust experimenteel kader om het effect van de kleine moleculen te bestuderen is cruciaal. We zagen dat het werkzame concentratiebereik van kleine molecule inhibitoren was gevoelig voor de voorkweek omstandigheden en de experimentele opstelling gebruikt om het effect van deze kleine molecule inhibitoren bestuderen. Verschillende rapporten, met name bestuderen B. subtilis onthulde variaties in het concentratietraject waarbij D-aminozuren remmen de vorming van pellicles – de drijvende bacteriële biofilms ^12,17-19. De hier gepresenteerde resultaten suggereren dat de volgende factoren verantwoordelijk zijn voor verschillen in de actieve concentratiegebied: de pre-kweekomstandigheden (logaritmische ^12,17 versus late stationaire groeifase ^20), het gebruikte groeimedium in de pre-kweekomstandigheid (rijk, undefined [Luria bouillon, LB] versus gedefinieerd [mononatriumglutamaatglycerol, MSgg]), de verhouding inoculatie het bijzonder het verwijderen van de pre-kweekmedium voor enting. De temperatuur van statische huidje groei vertoonden een minder belangrijke rol in het activiteitsgebied van de kleine molecule inhibitor D-leucine, representant D-aminozuur gebruikt in deze studie.

Tenslotte, zodra de biofilms worden behandeld met specifieke biofilm remmers, robuuste en informatief zijn vereist om de effecten van deze inhibitoren op biofilm fitness karakteriseren. Hier twee methoden onafhankelijk karakteriseren van het effect van kleine molecule inhibitoren worden beschreven: (1) Het effect op individuele cellen binnen een biofilm kolonie en hun resistentie tegen antimicrobiële agentia. Cellen in biofilms algemeen beter bestand tegen antibiotica vergeleken met vrijlevende bacteriën ^21-23. Hoewel dit fenomeen multifactorieel, werd het vermogen van de EPS antibiotische penetratie beperken vaak beschouwd als een aantrekkelijke verklaring ²⁴ </sup>. Deze methode beoordeelt de overleving van vooraf vastgestelde biofilm cellen na blootstelling aan antibacteriële stoffen. (2) Het effect op de biofilm kolonie architectuur van de grote tot de kleine schaal. Biofilm kolonies worden gekenmerkt door hun driedimensionale structuur en de aanwezigheid van de EPS. Gebruik scanning elektronenmicroscopie, kunnen veranderingen in de celmorfologie, biofilm kolonie structuur en architectuur en overvloed van het EPS worden gevisualiseerd door de grote (mm) de kleine schaal (micrometer).