Deneysel Enfeksiyon<em> Listeria monocytogenes</em> Ana İnterferon-γ Yanıtları incelenmesi için Bir Model Olarak
Summary
Bu protokol, Listeria monocytogenes EGD suşu ile (L. monocytogenes) C57BL / 6J fareleri aşılamak için ve doğal öldürücü (NK) hücreleri, doğal katil T (NKT) hücreler tarafından interferon-y (IFN-γ) tepkilerini ölçmek açıklamaktadır ve adaptif T sonrası enfeksiyon lenfosit. Bu protokol ayrıca patojen modifiye LD 50 dozu ile enfeksiyondan sonra farelerde hayatta kalma çalışmaları yürütmek açıklamaktadır.
Abstract
L. monocytogenes, insanlarda gıda kaynaklı bir hastalık nedeni olan gram pozitif bir bakteridir. Bu patojenin farelerin deneysel enfeksiyon hücre içi patojenlere karşı konak bağışıklık doğal ve kazanılmış bağışıklık hücreleri ve belirli sitokinler rolü son derece bilgilendirici olmuştur. L. monositogenleri öldürücü enfeksiyon sırasında doğal hücreler tarafından IFN-y üretimi, makrofajları ve patojen 1-3 erken harekete geçirilmesi için çok önemlidir. Buna ek olarak, uyarlanır bellek lenfositler tarafından IFN-γ üretimi yeniden enfeksiyona 4 üzerine doğal hücrelerinin aktivasyonunu kullanıma hazırlanması için çok önemlidir. L. böylece enfeksiyon modeli monocytogenes IFN-γ üretimini artırmak için tasarlanmış yeni tedaviler in vivo IFN-γ yanıtları üzerinde bir etkiye sahip ve bu tür bakteriyel açıklık artan ya da fare sağ kalımı iyileştirmek gibi üretken biyolojik etkilere sahip olup olmadığını araştırmak için harika bir araç olarak hizmet vermektedir itibarenenfeksiyon. L. monocytogenes EGD suşu ile C57BL / 6J fareler intraperitoneal enfeksiyonları yapmak için ve akış sitometrisi ile NK hücreleri, NKT hücreleri ve adaptif lenfosit IFN-γ üretimini ölçmek için nasıl temel protokol, aşağıda tarif edilmiştir. (1) büyür ve aşılama için bakteri hazırlanması (2) uç noktalara dalak ve karaciğer, ve (3) ölçüsü, hayvan yaşam bakteri yükünü ölçmek: Buna ek olarak, prosedür tarif edilmektedir. Örnek verileri, bu enfeksiyon modeli L. monocytogenes ve bu enfeksiyonun farelerin hayatta kalması için, IFN-γ yanıtları belirli maddelerin etkisini test etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek için verilmiştir.
Introduction
IFN-γ, hücre içi patojenlere karşı bağışıklık aracılık edecek ve tümör büyümesini 5 kontrol edilmesi için önemli olan bir sitokindir. Bakteriyel direnç, bu sitokinin önemi IFN-γ sinyalleme yolağında mutasyonlar mikobakteriler ve Salmonella 6 ile enfeksiyona karşı oldukça hassas olan sahip insanlar gözlem belirgindir. Aynı şekilde, fare IFN-y ya da L 10,11 monocytogenes dahil olmak üzere, mikobakteriler 7-9 ve diğer hücre içi patojenlere dirençte, IFN-γ reseptör sergi kusurlar ya Layişmanya majör 12, Salmonella typhimurium 13, ve bazı virüsler 11 eksikliği olan. Mücadele patojenlere ek olarak, IFN-γ tümörlere 14 karşı konak savunma önemli bir rol oynar. IFN-y ve yüksek üretim enfeksiyon ya da kanser bağlamında faydalı olmasına rağmen, bu sitokinin uzun süreli üretim t bağlantılıdırObez olmayan diyabetik fare modelinde 18 sistemik otoimmün 15-17 geliştirilmesi ve Çeşidi hızlandırılmasına O I diyabet.
IFN-y önemli kaynaklar, NK hücreleri, NKT hücreleri, γδ T hücrelerini, T yardımcı-1 (Th1) hücreler ve sitotoksik T lenfositler (CTL), 5,19,20 içerir. IFN-γ ile doğal ve kazanılmış bağışıklığı hem de geliştirir: (1) yukarı-regüle (3) arttırıcı makrofaj, (2) antijen sunan hücrelerde ko-stimülatör moleküllerinin ekspresyonunu arttırarak, majör histo-uyumluluk kompleksi (MHC) sınıf I ve II ifadesini fagositoz ve pro-inflamatuar sitokinlerin üretimi ve mikrop öldürücü etkenler (örneğin, nitrik oksit ve reaktif oksijen türleri), (4) (5) (immünoglobülin antikor sınıfı anahtarlama teşvik Th1 efektör hücrelere naif CD4 + T hücrelerinin farklılaşmasını teşvik Ig) 2a ve farede IgG3 (), (6) kemokinlerin üretimini indükleyen I sitelerine immün hücreleri işenfection, ve (7), NK hücreleri ve CTL karşılıklarını 5,19 artar. Patojenler ve tümörlere yanıtta IFN-y hayati önemi göz önüne alındığında, rekombinant IFN-γ (19 gözden) çeşitli enfeksiyonlara ve habis için bir tedavi olarak test edilmiştir. IFN-y ya da Th1 teşvik sitokin interlökin-12 (IL-12) ve sistemik uygulama yan etkileri ile ilişkili olan ve dozla ilişkili toksisite 19,21 olduğu için, ancak, IFN-γ üretimi artırmak için alternatif stratejiler geliştirilmesinde ilgi vardır immün hücreleri. Yeni biyolojik ve küçük moleküllerin geliştirilmesi, bu tür maddeler, bir immün tepkisi sırasında IFN-γ üretimini artırmak olmadığını test etmek için in vivo tarama araçları gerektirir olup, bu, hayvan hayatta kalma arttıkça anlamlı bir biyolojik etki anlamına gelir.
Gram-pozitif bakteri L. monocytogenes ile farelerin deneysel enfeksiyon için bir enstrümantal model olmuşturhücre içi patojenlere 1,22 karşı konak-bağışıklık IFN-y rolünü deşifre. patojen intravenöz veya intraperitoneal (ip) ile farelerin enfeksiyonu günlerce sonrası 3 ila 4 oluşan dalak zirve bakteriyel yükleri ile ikamet makrofajlar ve hepatositler tarafından içselleştirilmiş hale dalak ve karaciğer, bakterilerin hızla yayılmasına yol açar enfeksiyon 1,3,22. NK hücreleri ile IFN-y üretimi, makrofaj aktivasyonu ve patojen 3 karşı erken direnç için de önemlidir, Bununla birlikte, yüksek enfeksiyon dozlardaki, IFN-y üretimi, aynı zamanda patojen açıklık 23 için zararlı olabilir. NKT hücreleri, aynı zamanda patojen 2,24 erken kontrolü sırasında dalak ve karaciğerdeki IFN-y kaynağı ve bu üretim, NK hücreleri 2 dahil olmak üzere başka hücre tipleri tarafından IFN-γ üretimini yükseltmek için gösterilmiştir. Parti Diğer yandan, uyum sağlayıcı T lenfositler, daha sonra etkili, CD8 + T hücrelerivasküler, patojen temizlenmesini aracılık yeniden enfeksiyon 1,4,22 karşı koruma sağlamak için önemlidir.
Bu enfeksiyon modeli (1 gözden) bir takım nedenlerden araştırmacılar için cazip olmuştur. İlk olarak, patojen enfeksiyonu yüksek tekrarlanabilir ve Th1 ve güçlü hücresel bağışıklık tepkisi oluşturur. İkinci olarak, öldürücü enfeksiyon sırasında, bakteri yükü kolayca ölçülebilir karaciğer ve dalakta konsantre edilir. Üçüncü olarak, patojen güvenle Biyogüvenlik Seviyesi 2 (BSL2) koşullar altında ele alınabilir. Dördüncüsü, organizma ve bağışıklık tepkisi bu kapsamlı karakterize edilmiştir üretir olduğunu. Son olarak, mutant ve genetik olarak modifiye edilmiş suşların çeşitli kullanım için uygun olduğu geliştirilmiştir.
L. EGD suşu ile C57BL / 6J fareler aşılama için temel protokol, burada 25 monositogenlerinden olarak tanımlayan ve IFN ölçüm – γ yenidenNK, NKT ve adaptif lenfositler sonrası enfeksiyon tarafından leflimleri. Ayrıca açıklanan öldürücü enfeksiyon sonrası bakteri dalak yükü ve karaciğer ölçmek ve patojenin değiştirilmiş LD 50 dozu ile enfeksiyondan sonra hayatta kalma çalışmaları yürütmek için nasıl. Son olarak, Örnek veriler, bu protokol, L. monocytogenesin IFN-γ yanıtları ve fare hayatta kalma ile ilgili yeni tedavilerin etkisini taranması için kullanılabilir nasıl gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada L. EGD suşu kadın veya erkek C57BL / 6J farelerde 25 monocytogenes ile temel deneysel enfeksiyon yürütmek için nasıl bir protokol açıklar. Bu protokol, in vivo 31 doğal ve kazanılmış lenfositler tarafından IFN-γ üretimi üzerinde yeni küçük moleküllü IS001 etkisini incelemek amacıyla kuruldu. bakteriyel temizleme ve hayatta kalma sonrası enfeksiyon izleyerek, anlayışlar IFN-y bu değişikliklerin enfeksiyon kontrol etme konağın yeteneğini…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.
Materials
| Brain Heart Infusion Broth, Modified | BD | 299070 | any brand should be appropriate |
| Agar | BD | 214010 | any brand should be appropriate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | any brand should be appropriate |
| 1xPBS | Sigma | D8537 | any brand should be appropriate |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | any brand should be appropriate |
| Ammonium Chloride (NH3Cl) | any brand should be appropriate | ||
| KHCO3 | any brand should be appropriate | ||
| Na2EDTA | any brand should be appropriate | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | any brand should be appropriate |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483 | Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | any brand should be appropriate |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140 | any brand should be appropriate |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | any brand should be appropriate |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD | 554724 | Use 4 μl in 6 ml cell culture |
| 16% Paraformaledehye | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS |
| 10 x Perm/Wash buffer | BD | 554723 | Dilute 10x in ddH20 |
| Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Dilute 1:50 |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes) |
| anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| PBS57/mCD1d tetramer-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | Obtained as a gift from the facility |
| anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| Mouse IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant |
| 50 mL vented tubes for culture | Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate | ||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | any brand should be appropriate | ||
| bacterial petri dishes | any brand should be appropriate | ||
| 2 ml cyrovials | any brand should be appropriate | ||
| UV spectrometer | any brand should be appropriate | ||
| safety engineered needles | any brand should be appropriate | ||
| C57BL6/J | Jackson laboratories | Stock#000664 | Order for arrival at 7 wks |
| Bleach | For decontamination | ||
| 70% Ethanol | For decontamination | ||
| Glass beads | any brand should be appropriate | ||
| Centrifuge | rotor, buckets, bucket covers. | ||
| Microcentrifuge | any brand should be appropriate | ||
| Sterile Glycerol | any brand should be appropriate | ||
| Pipette Tips | any brand should be appropriate | ||
| Pipette | any brand should be appropriate | ||
| Surgical instruments | any brand should be appropriate | ||
| 70 micron strainers | any brand should be appropriate | ||
| 3 ml syringe | any brand should be appropriate | ||
| Pipette gun | any brand should be appropriate | ||
| Filtration Units | any brand should be appropriate | ||
| Trypan Blue | Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate | ||
| Hemocytometer | any brand should be appropriate | ||
| Round bottomed plates | any brand should be appropriate | ||
| FACs tubes | BD | ||
| BD LSR II | BD | Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes | |
| Flowjo software | Treestar | Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate | |
| Multichannel pipettor (0-300 µl) | Eppendorf | Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining | |
| Acetic Acid | Used for washing glass beads, any brand should be appropriate | ||
| Microbank Bacterial Preservation System | Pro-lab Diagnositics | Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria |
References
- Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
- Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
- Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
- Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
- Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
- Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
- Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
- Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
- Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
- Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
- Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
- Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
- Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
- Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
- Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
- Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
- Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
- Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
- Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
- Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
- Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
- Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
- Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
- Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research–issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
- Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
- Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
- Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
- Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
- Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
- Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
- Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D’Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381 (2013).
- Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
- Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
- Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
- Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
- Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
- Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
- Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
- Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).
