Infezione sperimentale con<em> Listeria monocytogenes</em> Come modello per lo studio Host Interferone-gamma Risposte
Summary
Questo protocollo descrive come inoculare topi C57BL / 6J con il ceppo EGD di Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) e per misurare l'interferone-γ (IFN-γ) risposte da parte delle cellule natural killer (NK), cellule T natural killer (NKT), e adattiva linfociti T dopo l'infezione. Questo protocollo descrive anche come condurre studi di sopravvivenza in topi dopo l'infezione con una versione modificata del DL 50 dosi del patogeno.
Abstract
L. monocytogenes è un batterio gram-positivo che è una causa di origine alimentare malattie negli esseri umani. infezione sperimentale di topi con questo agente patogeno è stato molto istruttivo sul ruolo delle cellule immunitarie innate e adattative e citochine specifiche immunità dell'ospite contro gli agenti patogeni intracellulari. La produzione di IFN-γ da parte delle cellule innate durante l'infezione subletale con L. monocytogenes è importante per l'attivazione di macrofagi e il controllo precoce del patogeno 1-3. Inoltre, la produzione di IFN-γ da linfociti memoria adattativi è importante per l'innesco l'attivazione delle cellule innate upon reinfezione 4. La L. monocytogenes modello di infezione quindi serve come un ottimo strumento per indagare se le nuove terapie che sono progettati per aumentare la produzione di IFN-γ avere un impatto sulle risposte IFN-γ in vivo e hanno effetti biologici produttivi come l'aumento gioco batterica o migliorare la sopravvivenza del mouse da parte diinfezione. Qui descritto è un protocollo di base per il modo di condurre le infezioni intraperitoneale di C57BL / 6J topi con il ceppo EGD di L. monocytogenes e per misurare la produzione di IFN-γ da parte delle cellule NK, cellule NKT e linfociti adattivi mediante citometria di flusso. Inoltre, le procedure sono descritte a: (1) crescere e preparare i batteri per l'inoculazione, (2) misurare carica batterica nella milza e nel fegato, e (3) la sopravvivenza misura animale endpoint. Dati rappresentativi sono inoltre forniti per illustrare come questo modello infezione può essere utilizzato per testare l'effetto di agenti specifici sulle risposte IFN-y a L. monocytogenes e la sopravvivenza di topi da questa infezione.
Introduction
IFN-γ è una citochina che è cruciale per mediare l'immunità contro i patogeni intracellulari e per il controllo della crescita tumorale 5. L'importanza di questa citochina nella resistenza batterica è evidente nell'osservazione che gli esseri umani con mutazioni nel percorso di segnalazione di IFN-γ sono altamente suscettibili all'infezione con micobatteri e salmonelle 6. Allo stesso modo, i topi carenti di entrambi IFN-γ o difetti del recettore espositive IFN-γ nella resistenza alla micobatteri 7-9 e altri agenti patogeni intracellulari, tra cui L. monocytogenes 10,11, Leishmania importante 12, Salmonella typhimurium 13, e alcuni virus 11. Oltre agli agenti patogeni Lotta contro, IFN-γ gioca un ruolo cruciale in Host-difesa contro i tumori 14. Sebbene maggiore produzione di IFN-γ è utile nel contesto di infezione o tumore, la produzione prolungata di questa citochina è stato collegato to lo sviluppo di autoimmunità sistemica 15-17 e l'accelerazione del diabete di tipo I nei diabetici non obesi modello di topo 18.
Le principali fonti di IFN-γ includono le cellule NK, cellule NKT, γδ cellule T helper, le cellule T 1 (Th1), e linfociti T citotossici (CTL) 5,19,20. IFN-γ migliora sia innata e adattativa per: (1) up-regolazione complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) classe I e II espressione, (2) aumentare l'espressione di molecole co-stimolatorie sulle cellule presentanti l'antigene, (3) macrofagi migliorare fattori fagocitosi e la produzione di citochine pro-infiammatorie e microbicidi (ad esempio, l'ossido di azoto e le specie reattive dell'ossigeno), (4) promuovere la differenziazione delle cellule T CD4 + naive in cellule effettrici Th1, (5) promuovere il passaggio di classe di anticorpi di immunoglobuline ( Ig) 2a e IgG3 (nel topo), (6) inducendo la produzione di chemochine reclutare cellule immunitarie di siti di infection, e (7) miglioramento delle cellule NK e le risposte CTL 5,19. Data l'importanza cruciale di IFN-γ in risposta dell'ospite agli agenti patogeni e tumori, ricombinante IFN-γ è stato testato come trattamento per varie infezioni e neoplasie (recensito in 19). Tuttavia, a causa somministrazione sistemica di IFN-γ o citochina Th1 promuovere l'interleuchina-12 (IL-12) è associato ad effetti collaterali e dose-correlati tossicità 19,21, vi è interesse a sviluppare strategie alternative per aumentare la produzione di IFN-γ by cellule immunitarie. Sviluppo di nuovi farmaci biologici e piccole molecole richiede in strumenti di screening vivo per verificare se tali agenti aumentare la produzione di IFN-γ durante una risposta immunitaria e se questo si traduce in effetti biologici significativi come l'aumento della sopravvivenza degli animali.
Infezione sperimentale di topi con i gram-positivi batterio L. monocytogenes è stato un modello strumentale perdecifrare il ruolo di IFN-γ in host-immunità contro patogeni intracellulari 1,22. L'infezione dei topi con l'agente patogeno per via endovenosa o per via intraperitoneale (ip) porta alla rapida diffusione dei batteri alla milza e nel fegato, dove diventano internalizzati dai macrofagi residenti e epatociti con cariche batteriche picco nella milza che si verificano tra il 3 e 4 giorni post infezione 1,3,22. La produzione di IFN-γ da parte delle cellule NK è importante per l'attivazione dei macrofagi e la resistenza precoce contro l'agente patogeno 3; tuttavia a dosi elevate infettive, la produzione di IFN-γ può anche essere dannoso alla clearance dei patogeni 23. Cellule NKT sono anche una fonte di IFN-γ nella milza e nel fegato durante il controllo precoce di agenti patogeni 2,24 e questa produzione è stato dimostrato per amplificare la produzione di IFN-γ da altri tipi di cellule, tra cui le cellule NK 2. D'altra parte, in seguito ad azione adattativi linfociti T, cellule T CD8 + in partilare, sono importanti per mediare il gioco del patogeno e della protezione contro reinfezione 1,4,22.
Questo modello di infezione è stato interessante per i ricercatori per una serie di ragioni (rivisto in 1). Innanzitutto, l'infezione con il patogeno è altamente riproducibile e induce una forte Th1 e cellulare risposta immunitaria. In secondo luogo, durante l'infezione subletali, carica batterica è concentrata nel fegato e nella milza dove può essere facilmente misurata. In terzo luogo, l'agente patogeno può essere tranquillamente gestita sotto biosicurezza di livello 2 (BSL2) condizioni. In quarto luogo, l'organismo e la risposta immunitaria che genera sono stati ampiamente caratterizzati. Infine, una varietà di ceppi mutanti e geneticamente modificati sono stati sviluppati che sono disponibili per l'uso.
Qui descritto è un protocollo di base per l'inoculazione di C57BL 6J topi / con il ceppo EGD di L. monocytogenes 25 e per la misura di IFN – γ resposte da NK, NKT e linfociti adattivi post-infezione. Inoltre descritto è come misurare carica batterica nella milza e nel fegato dopo l'infezione subletali e di effettuare studi di sopravvivenza dopo infezione con un modificata LD 50 dose del patogeno. Infine, dati rappresentativi sono mostrati di come questo protocollo può essere usata per selezionare l'effetto di nuovi trattamenti sulle risposte IFN-gamma e la sopravvivenza mouse dalla L. monocytogenes infezione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui si descrive un protocollo di come effettuare una infezione sperimentale di base con il ceppo EGD di L. monocytogenes 25 in C57BL 6J maschi o femmine /. Questo protocollo è stato istituito con lo scopo di studiare l'effetto di un romanzo piccola molecola IS001 sulla produzione di IFN-γ da parte dei linfociti innata e adattativa in vivo 31. Monitorando la clearance batterica e la sopravvivenza dopo l'infezione, intuizioni sono state acquisite in modo questi cambiamenti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.
Materials
| Brain Heart Infusion Broth, Modified | BD | 299070 | any brand should be appropriate |
| Agar | BD | 214010 | any brand should be appropriate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | any brand should be appropriate |
| 1xPBS | Sigma | D8537 | any brand should be appropriate |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | any brand should be appropriate |
| Ammonium Chloride (NH3Cl) | any brand should be appropriate | ||
| KHCO3 | any brand should be appropriate | ||
| Na2EDTA | any brand should be appropriate | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | any brand should be appropriate |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483 | Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | any brand should be appropriate |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140 | any brand should be appropriate |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | any brand should be appropriate |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD | 554724 | Use 4 μl in 6 ml cell culture |
| 16% Paraformaledehye | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS |
| 10 x Perm/Wash buffer | BD | 554723 | Dilute 10x in ddH20 |
| Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Dilute 1:50 |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes) |
| anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| PBS57/mCD1d tetramer-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | Obtained as a gift from the facility |
| anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| Mouse IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant |
| 50 mL vented tubes for culture | Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate | ||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | any brand should be appropriate | ||
| bacterial petri dishes | any brand should be appropriate | ||
| 2 ml cyrovials | any brand should be appropriate | ||
| UV spectrometer | any brand should be appropriate | ||
| safety engineered needles | any brand should be appropriate | ||
| C57BL6/J | Jackson laboratories | Stock#000664 | Order for arrival at 7 wks |
| Bleach | For decontamination | ||
| 70% Ethanol | For decontamination | ||
| Glass beads | any brand should be appropriate | ||
| Centrifuge | rotor, buckets, bucket covers. | ||
| Microcentrifuge | any brand should be appropriate | ||
| Sterile Glycerol | any brand should be appropriate | ||
| Pipette Tips | any brand should be appropriate | ||
| Pipette | any brand should be appropriate | ||
| Surgical instruments | any brand should be appropriate | ||
| 70 micron strainers | any brand should be appropriate | ||
| 3 ml syringe | any brand should be appropriate | ||
| Pipette gun | any brand should be appropriate | ||
| Filtration Units | any brand should be appropriate | ||
| Trypan Blue | Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate | ||
| Hemocytometer | any brand should be appropriate | ||
| Round bottomed plates | any brand should be appropriate | ||
| FACs tubes | BD | ||
| BD LSR II | BD | Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes | |
| Flowjo software | Treestar | Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate | |
| Multichannel pipettor (0-300 µl) | Eppendorf | Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining | |
| Acetic Acid | Used for washing glass beads, any brand should be appropriate | ||
| Microbank Bacterial Preservation System | Pro-lab Diagnositics | Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria |
References
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