Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için<em> Drosophila</em> Larva
Summary
Drosophila ve memeli hematopoetik sistem hematopoez çalışmak için Drosophila çekici genetik model yapımı, birçok ortak özellikleri paylaşır. Burada İmmünohistokimyada için önemli larva hematopoetik organ diseksiyonu ve montajını göstermektedir. Ayrıca sirkülasyon hemocytes ve sesil kristal hücreleri dahil olmak üzere çeşitli larva hematopoietik bölmeleri tahlil etmek için yöntemler açıklanmaktadır.
Abstract
Birçok paralellik. Drosophila memeli adaptif bağışıklık karakterize lenfoid soyu eksikliği olsa bile, Drosophila ve memeli hematopoetik sistemler arasında mevcut Drosophila ve memeli hematopoez çeşitli kan hücre soylarından üretmek için mekansal ve zamansal farklı aşamalarında ortaya çıkar. Her iki sistem de genişletmek veya olgun soy yerine hangi kan hücresi atalarıdır rezervuarları korumak. Hematopoetik sistem Drosophila ve memeliler yanıt vermek ve bağışıklık zorluklara uyum sağlar. Önemlisi, nesil, bakım ve hematopoetik sistemin fonksiyonunu kontrol transkripsiyonel düzenleyicileri ve sinyal yolları memelilere sinekler muhafaza edilir. Bu benzerlikler Drosophila genetik model, hematopoetik gelişimi ve hastalığa kullanılmasına izin.
Burada ayrıntı deneyleri Drosophila larvaların hematopoetik sistemi incelemek için. İçindeÖzellikle, biz, kan hücre sayıları ve konsantrasyonu ölçmek in vivo belirli bir olgun soy görselleştirmek ve dolaşımdaki ve hematopoetik organ kan hücrelerinde immünhistokimya gerçekleştirmek için yöntemler özetlemektedir. Bu deneyler, gen ifadesi değişikliklerini ve sinyalizasyon, hayatta kalma, yayılması ve farklılaşma gibi hücresel süreçleri ortaya çıkarabilir ve hematopoezisi ilgili çeşitli sorular araştırmak için kullanılabilir. Drosophila uygun genetik araçlar ile birlikte, bu deneyler, tanımlanmış genetik değişiklikler üzerine hematopoietik sistem değerlendirmek için de kullanılabilir. Özellikle, burada belirtilen olmasa da, bu deneyler, aynı zamanda hematopoietik sistemi üzerinde enfeksiyon veya diyet gibi çevresel değişiklikleri, etkisini incelemek için kullanılabilir.
Introduction
hematolojik hastalıklarda hematopoetik sisteminin geliştirilmesi ve bu arızaya koordinat transkripsiyon faktörlerini ve sinyal yolları düzenleyen karmaşık mekanizmalar yeterince anlaşılamamıştır. Bu transkripsiyon faktörleri ve sinyal yolları, hem de bunların düzenlenmesi, yüksek Drosophila ve memeli hematopoez 1-5 arasında muhafaza edilir. Böylece Drosophila hematopoetik sistem hematopoezisi ve altta yatan hematolojik hastalıkları kontrol moleküler mekanizmaları tanımlamak için mükemmel bir genetik modeli temsil etmektedir.
Memelilere benzer şekilde, Drosophila hemopoeziste mekansal ve zamansal farklı aşamalarında hemocytes denilen kan hücreleri, üretir. Geleneksel olarak, Drosophila hematopoez embriyonik mezoderm ve larva lenf bezinde fazlar sınırlı olabileceği düşünüldü. hematopoez da larva sapsız CLU meydana geldiği Son çalışmalar kanıtsters 6-8 karın yetişkin. plazmatositler ve kristal hücreleri: Tüm hematopoetik fazlar olgun hemocytes iki türleri üretmek. Plazmatositler fagositoz, doğal bağışıklık ve yara iyileşmesinde rol makrofaj benzeri hücrelerdir. Kristal hücreleri melanization, böcek bağışıklık tepkilerinin ve yara iyileşmesinde kullanılan bir reaksiyon için gerekli olan ön-fenoloksidazlar içerir. Üçüncü olgun hemocyte türü oluşturabilir Larva hematopoez gibi parazitoit eşek arısı enfeksiyonu 9,10 gibi bazı bağışıklık zorluklara cevaben, bir lamellocyte çağırdı. Lamellocytes saklanması ve Drosophila larvalarının döşenen arısı yumurta nötralize etmek için, plazmatositler ve kristal hücreleri ile bağlantılı olarak, işlev büyük, yapışan hücreler bulunmaktadır. parazitlenme yokluğunda, lamellocytes vahşi tip larvaları bulunmaz. Melanotik kitleler melanized, kapsüllü yabanarısı yumurtalarını benzer; Birçok mutant Drosophila suşları Parazitlenme yokluğunda melanotik kitleleri geliştirmek. Lamello varlığılenfositler ve / veya melanotik kitleler hematopoetik anormalliklerin göstergesi olabilir. Aslında, melanotik toplu fenotipik hematopoez 11-14 katılan genler ve yolları belirlemek için kullanılmıştır.
larva hematopoetik sistem en yaygın Bugüne kadar incelenen olduğunu. Bu hemolimf dolaşan hemocytes oluşur, sapsız hemocyte manikür altında desenli kümeleri ve hemocytes lenf bezinde ikamet eden. Lenf bezi dorsal kabına bağlanmış ikili lobların dizisidir. Lenf bezinin her birincil lob üç ana bölgeye ayrılmıştır. en dış bölge kortikal bölge olarak bilinir ve hemocytes olgunlaştırma içerir. iç bölge medüller bölgesi olarak adlandırılan ve sakin hemosit öncülerinin oluşur. Üçüncü bölge, arka sinyal merkezi, kök hücre benzeri niş olarak hareket lenf bezi dibinde küçük bir hücre grubudur. Erken çalışma Notch 15-18 için kritik işlevleri kurulmuş </sup> Kirpi 19,20, JAK-STAT 18 ve Kanatsız 21 etkinlik larva lenf bezi gelişimini düzenler. Daha yeni çalışmalar BMP 22, FGF-Ras 23 ve Hippo 24,25 sinyal de larva lenf bezinde işlev olduğunu göstermiştir.
Burada belirtilen dört larva hematopoietik deneyleri 1) birim hacmi başına hücre sayısı olarak tanımlanır sirkülasyon hemocyte konsantrasyonunu ölçme 2) izole edilmesi ve sabitleme 3) in vivo olarak, kristal hücreleri görselleştirme, immünohistokimya için hemocytes sirkülasyon ve 4), sabitleme kesme ve montaj tarif lenf immünohistokimya için rakorlar. Bu deneyler, fonksiyonları ve larva hematopoietik sistem yolaklarını düzenlemeleri değerlendirmek için hematopoietik çıktılan olarak da kullanılabilir. Bu yöntemler, bu alanda daha önce kullanılmış olsa da, bu deneylerin görsel belgeler sadece son 8,26-30 başlamıştır. Burada belirtilen çeşitli yayınlar yardım vardırbenzer yöntemler ve hematopoietik işaretleri 26,31-33 tarif ful kaynaklar. Ayrıca, Trol ve Viking lenf bezi bazal membran kullanışlı göstergeleridir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genetik ya da çevresel değişiklik üzerine, burada açıklanan dört yöntem gibi sinyalizasyon, hayatta kalma, yayılması ve farklılaşma gibi hematopoez sırasında farklı süreçleri analiz etmek ayrı ayrı ya da birlikte kullanılabilir Drosophila hematopoez dinamik bir süreçtir.; hayvan başına hemocytes sayısı 35 artar ve lenf bezinin yapısı ve gen ifadesi gelişimi sırasında 32 değiştirir. Bu analizler gerçekleştirmeden önce, bu nedenle, o zaman sabit bir miktar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Matthew O’Connell, Maryam Jahanshahi, and Andreas Jenny for assistance. We thank István Andó for plasmatocyte-specific antibodies, Utpal Banerjee for dome-meso-EBFP2 flies, Julian Martinez-Agosto for antp>GFP flies, and Michael O’Connor for ptth and ptth>grim flies. These methods were developed with support by the Kimmel Foundation, the Leukemia & Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059, and NIH/NCI T32CA078207.
Materials
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
References
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
- Crozatier, M., Meister, M. Drosophila haematopoiesis. Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).
- Crozatier, M., Vincent, A. Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias. Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).
- Gold, K. S., Bruckner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
- Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response. Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. Elife. 4, (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier. PLoS Biol. 2 (8), 196 (2004).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Minakhina, S., Steward, R. Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes. Genetics. 174 (1), 253-263 (2006).
- Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation. EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).
- Avet-Rochex, A., et al. An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis. BMC Dev Biol. 10, 65 (2010).
- Rodriguez, A., et al. Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster. Genetics. 143 (2), 929-940 (1996).
- Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm. Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).
- Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm. Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).
- Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis. Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).
- Krzemien, J., et al. Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre. Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).
- Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors. Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).
- Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).
- Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila. Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).
- Pennetier, D., et al. Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).
- Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function. Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).
- Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis. Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).
- Milton, C. C., et al. The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster. Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).
- Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis. Methods. 68 (1), 242-251 (2014).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J Vis Exp. (63), e3347 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).
- Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).
- Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M. Properties of the Larval Hemocytes of Drosophila-Melanogaster. Experientia. 36 (10), 1223-1226 (1980).
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila. Dev Biol. 230 (2), 243-257 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila. Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).
- Reimels, T. A., Pfleger, C. M. Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis. J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).
