Методы Изучить лимфа железой и гемоцитах в<em> Drosophila</em> личинки
Summary
Drosophila и системы гемопоэтические млекопитающих имеют много общих черт, что делает Drosophila привлекательную генетическую модель для изучения кроветворения. Здесь показано, рассечение и монтаж основного личиночной кроветворной органа для иммуногистохимии. Мы также опишем методы для анализа различных личиночной кроветворных отсеков, включая циркулирующих гемоцитов и скального кристаллических ячеек.
Abstract
Многие параллели существуют между дрозофилы и кроветворных систем млекопитающих, хотя дрозофила не хватает лимфоидного , которые характеризуют млекопитающих адаптивного иммунитета. Дрозофилы и гемопоэз млекопитающих происходят в пространстве и во времени различных фаз для получения нескольких клеточных клонов в крови. Обе системы поддерживают резервуары кровяных клеток-предшественников, с которым для расширения или замены зрелых родословных. Кроветворной системы позволяет дрозофилы и млекопитающих , чтобы реагировать на них и адаптироваться к иммунным вызовам. Важно отметить, что транскрипционные регуляторы и сигнальные пути, которые контролируют генерацию, техническое обслуживание и функции кроветворной системы сохраняются от мух до млекопитающих. Эти сходства позволяют дрозофилы , которые будут использоваться для генной модели развития кроветворной и болезни.
Здесь мы подробно анализы , чтобы исследовать кроветворную систему личинок дрозофилы. Вчастности, мы опишем методы измерения количества клеток крови и концентрацию, визуализируйте определенную зрелую линию в естественных условиях, а также выполнять иммуногистохимии на клетки крови в обращении и в кроветворной органе. Эти анализы могут выявить изменения в экспрессии генов и клеточных процессов, включая сигнализацию, выживание, пролиферации и дифференцировки и может быть использован для исследования различных вопросов, касающихся кроветворение. В сочетании с генетическими инструментов , имеющихся у дрозофилы, эти анализы могут быть использованы для оценки кроветворной системы при определенных генетических изменений. Хотя конкретно не указано здесь, эти анализы также могут быть использованы для изучения влияния экологических изменений, таких как инфекции или диеты, на кроветворной системы.
Introduction
Сложные механизмы, регулирующие факторы транскрипции и сигнальные пути, которые координируют развитие кроветворной системы и что неисправность в гематологических заболеваний остаются плохо понятыми. Эти факторы транскрипции и сигнальные пути, а также их регулирование, высоко консервативны между дрозофилы и кроветворения у млекопитающих 1-5. Таким образом, система гемопоэтических дрозофилы представляет собой отличную генетическую модель для определения молекулярных механизмов , контролирующих кроветворение и основные гематологические заболевания.
Подобно млекопитающих, дрозофилы генерировать клетки крови, называемые гемоцитов, в пространстве и во времени различных фаз кроветворения. Традиционно Drosophila кроветворения считалось ограничивается фазами в эмбриональном мезодермы и в личиночной лимфатических желез. Недавние исследования свидетельствуют о том, что кроветворение происходит также в личиночной скального CLUSTERS и у взрослых живота 6-8. Все гемопоэтические фазы производят два типа зрелых гемоцитов: плазматоцитами и кристаллических ячеек. Плазматоциты являются макрофагами, как клетки, участвующие в фагоцитозе, врожденного иммунитета и заживления ран. Хрустальные клетки содержат про-phenoloxidases необходимые для меланизации, реакции, используемой в насекомых иммунных реакций и заживление ран. Личинки кроветворение может формировать третий зрелый тип гемоцитов, называемый lamellocyte, в ответ на определенные иммунные проблемы , такие как паразитоид осы инфекции 9,10. Lamellocytes большие, прилипшие клетки , которые функционируют в сочетании с плазматоцитами и кристаллических ячеек, чтобы инкапсулировать и нейтрализовать оса яиц , откладываемых у личинок дрозофилы. При отсутствии паразитированием, lamellocytes не встречаются у личинок дикого типа. Меланотический массы напоминают melanized, инкапсулированные оса яйца; многие мутантные штаммы Drosophila развиваются меланотический массы при отсутствии паразитирования. Присутствие lamellocytes и / или меланотический массы могут свидетельствовать о гемопоэтических нарушений. На самом деле, меланотический масса фенотип была использована для идентификации генов и путей , участвующих в кроветворении 11-14.
Личиночной гемопоэтических система является наиболее широко изучены на сегодняшний день. Она состоит из форменных циркулирующих в гемолимфе, сидячие гемоцитов кластеры узорчатый под кутикулой и гемоцитов проживающих в лимфатической железе. Лимфатических желез представляет собой ряд двусторонних лепестков, прикрепленных к спинным судна. Каждый первичный мочка лимфатических желез делится на три основные зоны. Наиболее удаленный от центра зоны известна как корковой зоны и содержит созревание гемоцитов. Самая внутренняя зона называется костномозговой зона и состоит из покоящихся предшественников гемоцитов. Третья зона, задняя сигнальным центром, является небольшая группа клеток у основания уплотнение лимфатических узлов, которые действуют как клеточноподобного ниши стволовых клеток. Ранние работы установили критические функции для Notch 15-18 </suр>, Еж 19,20, JAK-STAT 18 и Бескрылый 21 активность регулировать развитие личиночной лимфатических желез. Более поздние исследования показали , что ВМР 22, FGF-Ras 23, и Бегемот 24,25 сигнализации также функционируют в личиночной лимфатических желез.
Четыре личиночных гемопоэтические анализы , описанные здесь , описывают 1) измерение циркулирующей концентрации гемоцитов, определяемый как количество ячеек в единице объема, 2) выделение и фиксация циркулирующих гемоцитов для иммуногистохимии, 3) визуализации кристаллических клеток в живом организме , и 4) рассечения, фиксация, и монтаж лимфатических желез для иммуногистохимии. Эти анализы могут быть использованы в качестве гемопоэтических считываний для оценки функции и положения сигнальных путей в личиночной кроветворной системы. Хотя эти методы были использованы ранее в этой области, визуальной документации этих анализов началось лишь недавно 8,26-30. Несколько публикаций, цитируемые здесь помощьFul ресурсы , описывающие подобные методы и гемопоэтические маркеры 26,31-33. Кроме того, Троль и Viking являются полезными маркерами лимфы базальной мембраны железы.
Protocol
Representative Results
Discussion
При генетической или экологической изменения, четыре метода , описанные здесь , могут использоваться по отдельности или в сочетании для анализа различных процессов при кроветворении , такие как сигнализация, выживание, пролиферации и дифференцировки Drosophila кроветворения представ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Matthew O’Connell, Maryam Jahanshahi, and Andreas Jenny for assistance. We thank István Andó for plasmatocyte-specific antibodies, Utpal Banerjee for dome-meso-EBFP2 flies, Julian Martinez-Agosto for antp>GFP flies, and Michael O’Connor for ptth and ptth>grim flies. These methods were developed with support by the Kimmel Foundation, the Leukemia & Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059, and NIH/NCI T32CA078207.
Materials
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
References
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
- Crozatier, M., Meister, M. Drosophila haematopoiesis. Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).
- Crozatier, M., Vincent, A. Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias. Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).
- Gold, K. S., Bruckner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
- Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response. Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. Elife. 4, (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier. PLoS Biol. 2 (8), 196 (2004).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Minakhina, S., Steward, R. Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes. Genetics. 174 (1), 253-263 (2006).
- Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation. EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).
- Avet-Rochex, A., et al. An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis. BMC Dev Biol. 10, 65 (2010).
- Rodriguez, A., et al. Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster. Genetics. 143 (2), 929-940 (1996).
- Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm. Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).
- Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm. Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).
- Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis. Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).
- Krzemien, J., et al. Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre. Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).
- Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors. Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).
- Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).
- Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila. Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).
- Pennetier, D., et al. Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).
- Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function. Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).
- Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis. Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).
- Milton, C. C., et al. The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster. Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).
- Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis. Methods. 68 (1), 242-251 (2014).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J Vis Exp. (63), e3347 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).
- Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).
- Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M. Properties of the Larval Hemocytes of Drosophila-Melanogaster. Experientia. 36 (10), 1223-1226 (1980).
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila. Dev Biol. 230 (2), 243-257 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila. Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).
- Reimels, T. A., Pfleger, C. M. Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis. J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).
