Métodos para examinar a linfa Gland e Hemócitos em<em> Drosophila</em> Larvas
Summary
Sistemas hematopoiéticas de mamífero Drosophila e compartilham muitas características comuns, tornando Drosophila um modelo genético atraente para estudar hematopoiese. Aqui demonstramos dissecção e montagem do principal órgão hematopoiético larval para imuno-histoquímica. Descrevemos também métodos para ensaiar vários compartimentos hematopoiéticos larvais incluindo hemócitos circulantes e células de cristal sésseis.
Abstract
Existem muitos paralelos entre os sistemas hematopoiéticas de mamífero Drosophila e, apesar de Drosophila não têm a linhagem linfóide que caracterizam a imunidade adaptativa mamíferos. Drosophila e hematopoiese mamíferos ocorrem em espacial e temporalmente fases distintas para produzir várias linhagens de células sanguíneas. Ambos os sistemas manter reservatórios de progenitores de células de sangue com que se expandem ou substituem linhagens maduros. O sistema hematopoiético permite Drosophila e mamíferos para responder e se adaptar aos desafios do sistema imunológico. Mais importante, os reguladores de transcrição e de vias de sinalização que controlam a geração, manutenção e funcionamento do sistema hematopoiético são conservados a partir de moscas para mamíferos. Estas semelhanças Drosophila permitem a ser utilizado para o desenvolvimento hematopoiético e geneticamente modelo de doença.
Aqui nós ensaios detalhe para examinar o sistema hematopoiético de larvas de Drosophila. Dentroem particular, descrevemos métodos para medir o número de células de sangue e concentração, visualizar uma linhagem madura específica in vivo e realizar imuno-histoquímica em células sanguíneas em circulação e no órgão hematopoiético. Estes ensaios podem revelar alterações na expressão de genes e processos celulares, incluindo a sinalização, a sobrevivência, a proliferação, a diferenciação e a e podem ser utilizados para investigar uma variedade de questões relacionadas com a hematopoiese. Combinado com as ferramentas genéticas disponíveis em Drosophila, estes ensaios podem ser utilizados para avaliar o sistema hematopoiético em cima alterações genéticas definidas. Embora não seja especificamente descrito aqui, estes ensaios também podem ser utilizados para examinar o efeito de alterações ambientais, tais como infecção ou dieta, do sistema hematopoiético.
Introduction
Os complexos mecanismos que regulam os factores de transcrição e as vias de sinalização que coordenam o desenvolvimento do sistema hematopoiético e que o mau funcionamento nas doenças hematológicas permanecem pouco compreendidos. Estes factores de transcrição e as vias de sinalização, bem como a sua regulação, são altamente conservados entre mamíferos a Drosophila e hematopoiese 1-5. Assim, o sistema hematopoiético de Drosophila representa um excelente modelo genético para definir os mecanismos moleculares que controlam a hematopoiese e doenças hematológicas subjacentes.
Semelhante a mamíferos, Drosophila gerar células sanguíneas, chamados hemócitos, em espacial e temporalmente distintas fases da hematopoiese. Tradicionalmente, a hematopoiese de Drosophila foi pensado para ser limitada a fases na mesoderme embrionária e no gânglio linfático larvar. Estudos recentes fornecem evidências de que a hematopoiese também ocorre em Clu sésseis larvalsters e no abdômen adulto 6-8. Todas as fases hematopoiéticas produzem dois tipos de hemócitos maduros: plasmatócitos e células de cristal. Plasmatócitos são células de macrófagos-like envolvidos na fagocitose, a imunidade inata, e cicatrização de feridas. células de cristal conter pro-fenoloxidases necessários para melanização, uma reacção utilizado nas respostas imunes de insectos e cicatrização de feridas. Hematopoiese larval pode gerar um terceiro tipo de hemócitos madura, um chamado lamellocyte, em resposta a certos desafios imunológicos tais como infecção parasitóides vespa 9,10. Lamellocytes são células grandes e aderentes que funcionam, em conjunto com plasmatócitos e células de cristal, para encapsular e neutralizar os ovos de vespa estabelecidas em larvas de Drosophila. Na ausência de parasitismo, lamellocytes não são encontradas no tipo selvagem larvas. massas melanotic assemelham melanizadas, ovos de vespa encapsulados; muitas estirpes mutantes de Drosophila desenvolver massas melanóticos na ausência de parasitismo. A presença de Lamellocitos e / ou massas melanóticos pode ser indicativo de anormalidades hematopoiéticas. Na verdade, o fenótipo de massa melanóticos foi usado para identificar genes e vias envolvidas na hematopoiese 11-14.
O sistema hematopoiético larval é a mais estudada até o momento. É composto de hemócitos circulantes na hemolinfa, aglomerados de hemócitos sésseis modelado sob a cutícula, e hemócitos residente no gânglio linfático. O gânglio linfático é uma série de lóbulos bilaterais ligados ao vaso dorsal. Cada lóbulo principal da glândula linfa é dividido em três zonas principais. A zona mais externa é conhecida como a zona cortical e contém amadurecimento hemócitos. A zona mais interior é chamado a zona medular e é composta de precursores de hemócitos quiescentes. A terceira zona, o centro de sinalização posterior, é um pequeno grupo de células na base do gânglio linfático que actuam como um nicho de células-tronco como. Os primeiros trabalhos estabelecida funções críticas para Notch 15-18 </sup>, Hedgehog 19,20, JAK-STAT 18 e atividade Wingless 21 para regular o desenvolvimento da glândula linfática larval. Estudos mais recentes têm demonstrado que a BMP 22, FGF-23 de Ras, e Hipopótamo 24,25 sinalização também funcionar dentro do gânglio linfático larvar.
Quatro ensaios hematopoiéticas larvais descritas aqui descrever 1) de medição de circulação concentração de hemócitos, definida como o número de células por unidade de volume, 2) isolamento e fixação hemócitos circulantes para imuno-histoquímica, 3) a visualização de células de cristal in vivo, e 4) de dissecação, de fixação e de montagem gânglios linfáticos para imuno-histoquímica. Estes ensaios podem ser usados como leituras hematopoiéticas para avaliar as funções e os regulamentos de vias de sinalização no sistema hematopoiético das larvas. Embora estes métodos tenham sido utilizados anteriormente no campo, documentação visual destes ensaios só recentemente começou 8,26-30. Várias publicações citadas aqui são de ajudaful recursos que descrevem métodos semelhantes e marcadores hematopoiéticas 26,31-33. Além disso, Trol e Viking são marcadores úteis da membrana linfático glândula porão.
Protocol
Representative Results
Discussion
Após a alteração genética ou ambiental, os quatro métodos descritos aqui podem ser utilizados individualmente ou em conjunto para analisar processos distintos durante a hematopoiese, tais como sinalização, a sobrevivência, a proliferação, a diferenciação e a hematopoiese de Drosophila é um processo dinâmico.; o número de hemócitos por animal aumenta 35 e a expressão do gene e a estrutura do gânglio linfático muda 32 durante o desenvolvimento. Antes da realização do ens…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Matthew O’Connell, Maryam Jahanshahi, and Andreas Jenny for assistance. We thank István Andó for plasmatocyte-specific antibodies, Utpal Banerjee for dome-meso-EBFP2 flies, Julian Martinez-Agosto for antp>GFP flies, and Michael O’Connor for ptth and ptth>grim flies. These methods were developed with support by the Kimmel Foundation, the Leukemia & Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059, and NIH/NCI T32CA078207.
Materials
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
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