שיטות לבדיקת בלוטת לימפה hemocytes ב<em> תסיסנית</em> זחלים
Summary
תסיסנית ומערכות hematopoietic יונקים חולקים הרבה מאפיינים משותפים, מה שהופך תסיסנית מודל גנטי אטרקטיבי ללמוד hematopoiesis. כאן אנו מדגימים לנתיחת הרכבה של איבר hematopoietic הגדול זחל אימונוהיסטוכימיה. כמו כן, אנו מתארים שיטות Assay שונים תאי hematopoietic זחל כולל hemocytes במחזור ותאי קריסטל נייחים.
Abstract
קבלות רבות קיימות בין תסיסנית ומערכות hematopoietic יונקות, למרות תסיסנית חסרות את שושלת הלימפה מאפיינות חסינות אדפטיבית יונקת. תסיסנית hematopoiesis יונק להתרחש שלבים ברורים במרחב ובזמן כדי לייצר כמה שושלות תאי דם. שני המערכות לשמור מאגרים של אבות תא דם שבה להרחיב או להחליף שושלות בוגרות. מערכת hematopoietic מאפשרת תסיסנית ויונק להגיב ולהתאים לאתגרים חיסוניים. חשוב לציין, הרגולטורים תעתיק מסלולי איתות השולטים הדור, תחזוקה, והתפקוד של מערכת hematopoietic שמורים מפני זבובים ליונקים. דמיון אלה מאפשרים תסיסנית לשמש לפיתוח ומחלות hematopoietic מודל גנטי.
כאן אנו מבחני פרט לבחון את מערכת hematopoietic של הזחלים תסיסנית. בבפרט, אנו המתאר שיטות למדוד במספרי תא דם וריכוז, לדמיין שושלת בוגרת ספציפית in vivo, ולבצע אימונוהיסטוכימיה על תאי דם שבמחזור באיבר hematopoietic. מבחנים אלה יכולים לגלות שינויים בביטוי גנים ואת תהליכים תאיים כולל איתות, הישרדות, התפשטות, בידול יכולים לשמש כדי לחקור מגוון רחב של שאלות הנוגעות hematopoiesis. בשילוב עם הכלים הגנטיים הזמינים תסיסנית, יכולים לשמש מבחנים אלה כדי להעריך את מערכת hematopoietic על שינויים גנטיים מוגדרים. אמנם לא התווה במיוחד כאן, מבחנים אלה יכולים לשמש גם כדי לבחון את השפעת שינויים סביבתיים, כגון זיהום או דיאטה, על מערכת hematopoietic.
Introduction
המנגנונים המורכבים המסדירים את גורמי שעתוק מסלולי איתות כי לתאם את הפיתוח של מערכת hematopoietic וכי תקלה במחלות המטולוגיות להישאר ממעטים להבין. גורמי שעתוק אלה מסלולי איתות, כמו גם הוויסות שלהם, הם שמורים ביותר בין תסיסנית יונקי hematopoiesis 1-5. לכן מערכת hematopoietic תסיסנית מייצגת מודל גנטי מעולה להגדיר את המנגנונים המולקולריים השולטים hematopoiesis ומחלות המטולוגיות בסיסיות.
בדומה ליונקים, תסיסנית ליצור תאי דם, המכונה hemocytes, ב במרחב ובזמן שלבים ברורים של hematopoiesis. באופן מסורתי, hematopoiesis תסיסנית נחשב להיות מוגבל שלבי ביניים mesoderm העוברי בבלוטת הלימפה הזחל. מחקרים שנעשו לאחרונה לספק ראיות כי hematopoiesis מתרחשת גם CLU נייחים הזחלsters והן מבוגר בטן 6-8. כל שלבי hematopoietic לייצר שני סוגים של hemocytes הבוגרת: plasmatocytes ותאי קריסטל. Plasmatocytes הם תאים דמויי מקרופאג מעורב phagocytosis, חסינות מולדת, וריפוי פצעים. תאים קריסטל מכילים פרו-phenoloxidases הנדרשים melanization, תגובה המשמשת תגובות חיסוניות חרקים וריפוי פצעים. Hematopoiesis זחל יכול ליצור סוג hemocyte בוגרת שלישי, שנקרא lamellocyte, בתגובה לאתגרי חיסון מסוימים כגון זיהום צרעה טפיל 9,10. Lamellocytes גדול, תאים חסידים המתפקדים, בשיתוף עם plasmatocytes ותאי קריסטל, לתמצת ולנטרל ביצי צרעה הניחו זחלים תסיסנית. בהעדר parasitization, lamellocytes לא נמצא זחלי wild-type. המוני Melanotic להידמות ביצי צרעת melanized, כמוסות; רבי זנים תסיסנית מוטציה לפתח המוני melanotic בהעדר parasitization. הנוכחות של lamellocytes ו / או המוני melanotic יכול להצביע על ליקויי hematopoietic. למעשה, את הפנוטיפ המוני melanotic נעשה שימוש כדי לזהות גנים ושבילים מעורבים hematopoiesis 11-14.
מערכת hematopoietic הזחל הוא נרחב ביותר למד עד כה. היא מורכבת hemocytes במחזור hemolymph, אשכולות hemocyte נייחים בדוגמת תחת לציפורן, ו hemocytes המתגוררים בלוטת הלימפה. בלוטת הלימפה היא סדרה של אונות הבילטרליים מצורפות הכלי הגבה. כל אונה העיקרית של בלוטת הלימפה מחולקת לשלושה אזורים עיקריים. האזור החיצוני ידוע כאזור קליפת המוח ומכיל התבגרות hemocytes. האזור הפנימי ביותר נקרא האזור מדולרי והיא מורכבת מבשרי hemocyte שקטים. האזור השלישי, במרכז איתות האחורי, הוא קבוצה קטנה של תאים בבסיס של בלוטת הלימפה אשר פועלת נישה דמוית תא גזע. עבודה מוקדמת הוקמה פונקציות קריטיות עבור Notch 15-18 </sup>, קיפוד 19,20, JAK-STAT 18, ו כנפי 21 פעילות להסדיר התפתחות בלוטת הלימפה זחל. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי BMP 22, FGF-ראס 23, ו היפו 24,25 איתות גם לתפקד בתוך בלוטת הלימפה הזחל.
ארבעה מבחני hematopoietic הזחל המפורטים כאן לתאר 1) מדידת מחזורי ריכוז hemocyte, מוגדר כמספר של תאים ליחידת נפח, 2) בידוד ותיקון במחזור hemocytes אימונוהיסטוכימיה, 3) חזותי בתאי קריסטל in vivo, ו -4) לנתח, לתקן, ואת הרכבה הלימפה בלוטות אימונוהיסטוכימיה. מבחנים אלה יכולים לשמש readouts hematopoietic להעריך את הפונקציות והתקנות של מסלולי איתות במערכת hematopoietic הזחל. בעוד שיטות אלה שמשו בעבר בתחום, תיעוד חזותי של מבחנים אלה החל רק לאחרונה 8,26-30. מספר פרסומים שצוטטו כאן הם לעזרהמשאבי פול המתארים בשיטות דומות וסמני hematopoietic 26,31-33. בנוסף, Trol וויקינג הם סמנים השימושיים של קרום במרתף בלוטת הלימפה.
Protocol
Representative Results
Discussion
עם השינוי גנטי או סביבתי, ארבע השיטות שתוארו כאן ניתן להשתמש בנפרד או בשילוב לנתח תהליכים שונים במהלך hematopoiesis כגון איתות, הישרדות, שגשוג, והבחנת hematopoiesis תסיסנית היא תהליך דינאמי.; מספר hemocytes לכל חיה מגדיל 35 והביטוי מבנה הגן של בלוטת הלימפה משנה 32 במהלך ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Matthew O’Connell, Maryam Jahanshahi, and Andreas Jenny for assistance. We thank István Andó for plasmatocyte-specific antibodies, Utpal Banerjee for dome-meso-EBFP2 flies, Julian Martinez-Agosto for antp>GFP flies, and Michael O’Connor for ptth and ptth>grim flies. These methods were developed with support by the Kimmel Foundation, the Leukemia & Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059, and NIH/NCI T32CA078207.
Materials
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
References
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
- Crozatier, M., Meister, M. Drosophila haematopoiesis. Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).
- Crozatier, M., Vincent, A. Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias. Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).
- Gold, K. S., Bruckner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
- Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response. Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. Elife. 4, (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier. PLoS Biol. 2 (8), 196 (2004).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Minakhina, S., Steward, R. Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes. Genetics. 174 (1), 253-263 (2006).
- Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation. EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).
- Avet-Rochex, A., et al. An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis. BMC Dev Biol. 10, 65 (2010).
- Rodriguez, A., et al. Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster. Genetics. 143 (2), 929-940 (1996).
- Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm. Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).
- Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm. Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).
- Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis. Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).
- Krzemien, J., et al. Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre. Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).
- Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors. Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).
- Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).
- Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila. Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).
- Pennetier, D., et al. Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).
- Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function. Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).
- Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis. Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).
- Milton, C. C., et al. The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster. Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).
- Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis. Methods. 68 (1), 242-251 (2014).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J Vis Exp. (63), e3347 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).
- Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).
- Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M. Properties of the Larval Hemocytes of Drosophila-Melanogaster. Experientia. 36 (10), 1223-1226 (1980).
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila. Dev Biol. 230 (2), 243-257 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila. Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).
- Reimels, T. A., Pfleger, C. M. Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis. J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).
