Methoden, um die Lymphdrüsen und Blutzellen zu prüfen, die in<em> Drosophila</em> Larvae
Summary
Drosophila und Säugetieren hämatopoetischen Systeme haben viele gemeinsame Merkmale, Drosophila ein attraktives genetisches Modell machen Hämatopoese zu studieren. Hier zeigen wir Präparation und Lagerung des großen Larven hämatopoetischen Organ für die Immunhistochemie. Wir beschreiben Methoden auch verschiedene Larven hämatopoetischen Fächer einschließlich zirkulierenden Blutzellen und sessile-Zellen zu untersuchen.
Abstract
Viele Parallelen zwischen der Drosophila und Säugetieren hämatopoetischen Systems, obwohl Drosophila die lymphoiden Linie fehlt , die Säugetier-adaptive Immunität zu charakterisieren. Drosophila und Säugetieren Hämatopoese treten in räumlich und zeitlich getrennten Phasen mehrere Blutzelllinien zu erzeugen. Beide Systeme halten Stauseen von Blutvorläuferzellen mit dem reifen Linien zu erweitern oder zu ersetzen. Das hämatopoetische System ermöglicht Drosophila und Säugetieren zu reagieren und die Immun Herausforderungen anzupassen. Wichtig ist, dass die Transkriptionsregulatoren und Signalwege, die die Erzeugungssteuerung, Wartung und Funktion des hämatopoetischen Systems von Fliegen zu Säugetieren konserviert. Diese Ähnlichkeiten lassen Drosophila genetisch Modell hämatopoetischen Entwicklung und Krankheit verwendet werden.
Hier stellen wir ausführlich Assays , die die hämatopoetische System von Drosophila – Larven zu untersuchen. ImInsbesondere haben wir Methoden skizzieren Blutzellzahlen und Konzentration zu messen, eine bestimmte reife Linie in vivo sichtbar zu machen , und führen Sie die Immunhistochemie auf Blutzellen im Umlauf und in der hämatopoetischen Organ. Diese Assays können offenbaren Veränderungen in der Genexpression und zelluläre Prozesse einschließlich der Signalisierung, Überleben, Proliferation und Differenzierung und kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Fragen zu untersuchen Hämatopoese über. In Kombination mit den genetischen Werkzeuge zur Verfügung , in Drosophila können diese Assays verwendet werden , um das hämatopoetische System auf definierten genetischen Veränderungen zu bewerten. Während hier nicht näher erläutert, können diese Assays auch die Wirkung von Umweltveränderungen, wie Infektionen oder Diät, auf das hämatopoetische System zu prüfen, verwendet werden.
Introduction
Die komplexen Mechanismen, um die Transkriptionsfaktoren und Signalwege regulieren, die die Entwicklung des hämatopoetischen Systems und dass eine Fehlfunktion in hämatologischen Erkrankungen koordinieren bleiben schlecht verstanden. Diese Transkriptionsfaktoren und Signalwege sowie deren Regulation, zwischen Drosophila und Säuger Hämatopoese 1-5 hoch konserviert. So stellt das Drosophila hämatopoetische System ein hervorragendes genetisches Modell der molekularen Mechanismen zu definieren Hämatopoese und hämatologischen Krankheiten zu steuern.
Ähnlich wie bei Säugetieren, erzeugen Drosophila Blutzellen, genannt hemocytes, in räumlich und zeitlich getrennten Phasen der Hämatopoese. Traditionell wurde Drosophila Hämatopoese dachte in der embryonalen Mesoderm und im Larven Lymphdrüsen auf die Phasen beschränkt. Aktuelle Studien belegen, dass die Hämatopoese tritt auch in Larven sessil clusters und im erwachsenen Bauch 6-8. Alle hämatopoetischen Phasen produzieren zwei Arten von reifen Blutzellen: plasmatocytes und Kristallzellen. Plasmatocytes sind Makrophagen wie in Phagozytose, angeborene Immunität beteiligten Zellen und Wundheilung. Kristallzellen enthalten pro-Phenoloxydasen für melanization erforderlich, eine Reaktion in Insektenimmunreaktionen und Wundheilung eingesetzt. Larval Hämatopoese kann eine dritte reifen hemocyte Typ erzeugen, eine so genannte lamellocyte, als Reaktion auf bestimmte Immun Herausforderungen wie Legimmen Infektion 9,10. Lamellozyten sind groß, anhaftenden Zellen , die mit plasmatocytes und Kristallzellen in Verbindung funktionieren, Wespe Eier in Drosophila – Larven gelegt zu kapseln und zu neutralisieren. In Abwesenheit von Parasitierungsleistung, Lamellozyten sind nicht in Wildtyp-Larven gefunden. Melanotische Massen ähneln melanisierten, verkapselte Wespe Eier; viele Mutantenstämme entwickeln Drosophila melanotic Massen in Abwesenheit von Parasitierungsleistung. Die Anwesenheit von lamellozyten und / oder melanotischen Massen können indikativ hämatopoetischer Anomalien sein. In der Tat hat die melanotic Massen Phänotyp verwendet worden in der Hämatopoese 11-14 beteiligten Gene und -wege zu identifizieren.
Die Larven hämatopoetische System ist das am intensivsten die bisher untersucht. Es besteht aus Hämocyten in der Hämolymphe Zirkulieren sessile hemocyte Clustern unter der Cuticula strukturiert und Hämozyten in der Lymphdrüsen wohnen. Die Lymphdrüsen ist eine Reihe von bilateralen Lappen zur dorsalen Gefäß angebracht ist. Jede Primärkeule der Lymphdrüsen gliedert sich in drei Hauptzonen. Die äußerste Zone wird als der Rindenzone bekannt und enthält Reifung Hämocyten. Die innerste Zone wird der Markzone bezeichnet und ruhender hemocyte Vorläufern besteht. Die dritte Zone, die posterior Signalisierungszentrum, ist eine kleine Gruppe von Zellen an der Basis der Lymphdrüsen, die als Stammzelle artige Nischen wirken. Frühe Arbeiten etablierte kritische Funktionen für Notch 15-18 </sup>, Igel 19,20, JAK-STAT 18 und Aktivität Wingless 21 Larven Lymphdrüse Entwicklung zu regulieren. Neuere Studien haben gezeigt , dass BMP 22, FGF-Ras 23 und Hippo 24,25 Signalisierung auch innerhalb der Larven Lymphdrüse funktionieren.
Vier Larven hämatopoetischen Assays hier umrissenen beschreiben 1) Messung zirkulierender hemocyte Konzentration, definiert als Anzahl der Zellen pro Volumeneinheit, 2) Isolieren und Befestigungs hemocytes für die Immunhistochemie zirkulierende, 3) Kristallzellen in vivo zu visualisieren, und 4) zu sezieren, Fixierens und Befestigungs Lymphdrüsen für die Immunhistochemie. Diese Assays können als hämatopoetische Ablesungen verwendet werden, um die Funktionen und Regeln von Signalwegen im Larven hämatopoetische System zu bewerten. Während diese Verfahren bisher in dem Gebiet, visuelle Dokumentation dieser Assays verwendet wurde erst vor kurzem begonnen 8,26-30. Mehrere Veröffentlichungen hier zitiert sind Hilfeful Ressourcen beschreiben ähnliche Verfahren und hämatopoetischen Marker 26,31-33. Zusätzlich Trol und Viking sind nützliche Marker der Lymphdrüsen Basalmembran.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bei genetische oder umweltbedingte Veränderungen, die vier hier beschriebenen Verfahren können einzeln oder in Verbindung verwendet werden , um unterschiedliche Prozesse während der Hämatopoese analysieren wie Signalisierung, Überleben, Proliferation und Differenzierung Drosophila Hämatopoese ist ein dynamischer Prozess. die Anzahl der Hämozyten pro Tier erhöht 35 und die Struktur und die Genexpression der Lymphdrüsen ändert 32 während der Entwicklung. Vor dieser Tests durchfüh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Matthew O’Connell, Maryam Jahanshahi, and Andreas Jenny for assistance. We thank István Andó for plasmatocyte-specific antibodies, Utpal Banerjee for dome-meso-EBFP2 flies, Julian Martinez-Agosto for antp>GFP flies, and Michael O’Connor for ptth and ptth>grim flies. These methods were developed with support by the Kimmel Foundation, the Leukemia & Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059, and NIH/NCI T32CA078207.
Materials
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
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