Méthodes pour examiner la lymphe et Gland hémocytes dans<em> Drosophila</em> larves

Les mécanismes complexes qui régissent les facteurs de transcription et les voies de signalisation qui coordonnent le développement du système hématopoïétique et un dysfonctionnement dans les maladies hématologiques restent mal compris. Ces facteurs de transcription et les voies de signalisation, ainsi que leur régulation, sont hautement conservées entre la drosophile et l' hématopoïèse mammifère ^1-5. Ainsi , le système hématopoïétique Drosophila représente un excellent modèle génétique pour définir les mécanismes moléculaires contrôlant l' hématopoïèse et maladies hématologiques sous – jacentes.

Semblable à des mammifères, Drosophila générer des cellules sanguines, appelées hémocytes, dans spatialement et temporellement des phases distinctes de l' hématopoïèse. Traditionnellement, on pensait hématopoïèse chez la drosophile se limiter aux phases dans le mésoderme embryonnaire et dans les ganglions lymphatiques des larves. Des études récentes montrent que l'hématopoïèse se produit également dans des larves sessiles clustres et dans l'abdomen adulte ^8/6. Toutes les phases hématopoïétiques produisent deux types d'hémocytes matures: plasmatocytes et les cellules de cristal. Plasmatocytes sont des cellules de type macrophage impliqués dans la phagocytose, l'immunité innée et la guérison des plaies. les cellules à cristaux contiennent des pro-phénoloxydases nécessaires à la mélanisation, une réaction utilisé dans les réponses immunitaires d'insectes et la cicatrisation des plaies. Hématopoïèse larvaire peut générer un troisième type hémocytaire mature, appelée lamellocyte, en réponse à certains problèmes immunitaires telles que l' infection par le parasite guêpe ^9,10. Lamellocytes sont de grandes cellules adhérentes, qui fonctionnent en conjonction avec plasmatocytes et les cellules de cristal, afin d' encapsuler et de neutraliser les oeufs de guêpes définies dans les larves de Drosophila. En l'absence de parasitisme, lamellocytes ne sont pas trouvés dans de type sauvage larves. masses mélaniques ressemblent mélanisées, des œufs de guêpes encapsulées; de nombreuses souches mutantes de Drosophila développent des masses mélaniques en l'absence de parasitisme. La présence de lamellogamétocytes et / ou des masses mélaniques peuvent indiquer des anomalies hématopoiétiques. En effet, le phénotype de masse mélanique a été utilisé pour identifier les gènes et les voies impliquées dans l' hématopoïèse ^11-14.

Le système hématopoïétique larvaire est le plus largement étudié à ce jour. Il est composé d'hémocytes circulant dans l'hémolymphe, les clusters de hémocytes sessiles modelées sous la cuticule et les hémocytes résidant dans le ganglion lymphatique. Le ganglion lymphatique est une série de lobes bilatéraux attachés au vaisseau dorsal. Chaque lobe primaire du ganglion lymphatique est divisée en trois zones principales. La zone la plus extérieure est connue comme la zone corticale et contient maturation hémocytes. La zone la plus interne est appelée la zone médullaire et comprend des précurseurs d'hémocytes de quiescence. La troisième zone, le centre de signalisation postérieure, est un petit groupe de cellules à la base de la glande lymphatique qui agissent comme une niche de cellules ressemblant à la tige. Les premiers travaux mis en place des fonctions critiques pour Notch ^15-18 </sup>, Hedgehog ^19,20, JAK-STAT ¹⁸ et aptère ²¹ activité pour réguler le développement des glandes lymphatiques larvaire. Des études plus récentes ont démontré que la BMP ^{22, FGF-23} Ras et Hippo ^24,25 signalisation fonctionnent également dans le ganglion lymphatique des larves.

Quatre essais de hématopoiétiques larves présentées ici décrivent 1) à mesurer circulant concentration hémocytes, défini comme le nombre de cellules par unité de volume, 2) l' isolement et la fixation de circulation hémocytes pour l' immunohistochimie, 3) visualisant des cellules à cristaux in vivo et 4) disséquant, la fixation et le montage glandes lymphatiques pour l'immunohistochimie. Ces dosages peuvent être utilisés pour évaluer les lectures hématopoiétiques les fonctions et les règlements des voies de signalisation dans le système hématopoïétique des larves. Bien que ces méthodes ont été utilisées précédemment dans le domaine, la documentation visuelle de ces essais a commencé que récemment ^8,26-30. Plusieurs publications citées ici sont l'aideressources ful décrivant des méthodes similaires et les marqueurs hématopoïétiques ^26,31-33. En outre, Trol et Viking sont des marqueurs utiles de la membrane glande lymphatique du sous-sol.