طرق لفحص الليمفاوية الغدة وHemocytes في<em> ذبابة الفاكهة</em> يرقات
Summary
ذبابة الفاكهة والنظم المكونة للدم الثدييات تشترك في العديد من السمات المشتركة، مما يجعل ذبابة الفاكهة نموذجا جذابا الجيني لدراسة تكون الدم. نحن هنا لشرح تشريح والتركيب من الجهاز المكونة للدم اليرقات كبيرا لالمناعية. وصفنا أيضا أساليب لفحص مختلف الأجزاء المكونة للدم اليرقات بما في ذلك تعميم hemocytes وخلايا الكريستال اطئة.
Abstract
وجود العديد من أوجه الشبه بين ذبابة الفاكهة والنظم المكونة للدم الثدييات، على الرغم من ذبابة الفاكهة تفتقر إلى النسب اللمفاوية التي تميز مناعة التكيف الثدييات. ذبابة الفاكهة وتكون الدم الثدييات تحدث في مراحل متميزة مكانيا وزمانيا لإنتاج العديد من الأنساب خلايا الدم. كلا النظامين الحفاظ على خزانات الأسلاف خلايا الدم التي لتوسيع أو استبدال الأنساب ناضجة. ويسمح هذا النظام للدم ذبابة الفاكهة والثدييات للرد على والتكيف مع التحديات المناعية. الأهم من ذلك، هي الحفاظ على المنظمين النسخي ومسارات إشارات التي تتحكم في توليد والصيانة وظيفة من وظائف نظام المكونة للدم من الذباب إلى الثدييات. هذه التشابهات تسمح ذبابة الفاكهة لاستخدامها في التنمية المكونة للدم نموذجية وراثيا والمرض.
نحن المقايسات التفاصيل هنا لدراسة نظام المكونة للدم من يرقات ذبابة الفاكهة. فيعلى وجه الخصوص، ونحن الخطوط العريضة أساليب لقياس أعداد خلايا الدم وتركيز، تصور النسب ناضجة محددة في الجسم الحي، وتنفيذ المناعية على خلايا الدم في الدورة الدموية وفي الجهاز المكونة للدم. ويمكن لهذه المقايسات تكشف التغيرات في التعبير الجيني والعمليات الخلوية بما في ذلك إشارات والبقاء والانتشار، والتمايز، ويمكن استخدامها لتحقيق مجموعة متنوعة من الأسئلة المتعلقة تكون الدم. جنبا إلى جنب مع الأدوات الوراثية المتاحة في ذبابة الفاكهة، هذه المقايسات يمكن استخدامها لتقييم نظام المكونة للدم على تغيرات جينية محددة. في حين لم المبينة على وجه التحديد هنا، يمكن لهذه المقايسات أن تستخدم أيضا لدراسة تأثير التغيرات البيئية، مثل العدوى أو النظام الغذائي، وعلى نظام المكونة للدم.
Introduction
تبقى الآليات المعقدة التي تنظم عوامل النسخ ومسارات إشارات التي تنسق تطوير نظام المكونة للدم والتي عطل في الأمراض الدموية غير مفهومة. هذه عوامل النسخ ومسارات إشارات، فضلا عن تنظيمها، وحفظها للغاية بين ذبابة الفاكهة وتكون الدم في الثدييات 1-5. وهكذا يمثل نظام المكونة للدم ذبابة الفاكهة نموذجا الجيني ممتازة لتحديد الآليات الجزيئية التي تتحكم تكون الدم والأمراض الدموية الكامنة.
على غرار الثدييات، ذبابة الفاكهة توليد خلايا الدم، وتسمى hemocytes، في مراحل متميزة مكانيا وزمانيا تكون الدم. تقليديا، كان يعتقد ذبابة الفاكهة تكون الدم أن يقتصر على مراحل في الأديم المتوسط الجنينية وفي الغدة الليمفاوية اليرقات. توفر الدراسات التي أجريت مؤخرا أدلة على أن يحدث تكون الدم أيضا في CLU اطئة اليرقاتsters والكبار البطن 6-8. جميع المراحل المكونة للدم تنتج نوعين من hemocytes ناضجة: plasmatocytes والخلايا وضوح الشمس. Plasmatocytes هي مثل بلعم الخلايا المشاركة في البلعمة، والحصانة الفطرية، والتئام الجروح. خلايا الكريستال تحتوي الموالية للphenoloxidases اللازمة لالتصبغ، وهو رد فعل المستخدمة في الاستجابات المناعية الحشرات والتئام الجروح. تكون الدم اليرقات يمكن أن تولد الثالث ناضجة نوع كرية دموية، ودعا lamellocyte، ردا على بعض التحديات المناعة مثل طفيل العدوى دبور 9،10. Lamellocytes هي كبيرة، الخلايا الملتصقة التي تعمل بالتعاون مع plasmatocytes والخلايا وضوح الشمس، لتغليف وتحييد البيض دبور ضعت في يرقات ذبابة الفاكهة. في غياب التطفل، لم يتم العثور lamellocytes في البرية من نوع اليرقات. الجماهير الميلانية تشبه melanized والبيض دبور مغلفة. العديد من سلالات ذبابة الفاكهة متحولة تطوير الجماهير الميلانية في غياب التطفل. وجود lamellocytes و / أو الجماهير الميلانية يمكن أن يكون مؤشرا على التشوهات الجنينية. في الواقع، لقد تم استخدام النمط الظاهري الشامل الميلاني لتحديد الجينات والممرات المشتركة في تكون الدم 11-14.
نظام المكونة للدم اليرقات هو درس أكثر على نطاق واسع حتى الآن. وهي تتألف من hemocytes المتداولة في الدملمف، مجموعات كرية دموية اطئة نمط تحت إهاب، وhemocytes المقيمين في الغدة الليمفاوية. الغدة الليمفاوية هو عبارة عن سلسلة من الفصوص الثنائية تعلق على سفينة الظهرية. وينقسم كل فص الرئيسي للغدة الليمفاوية إلى ثلاث مناطق رئيسية. ومن المعروف أن منطقة الأبعد كما في منطقة القشرية ويحتوي بتاريخ استحقاق hemocytes. ويطلق على منطقة أعمق في منطقة النخاع وتتألف من السلائف كرية دموية هادئة. المنطقة الثالثة، وسط الخلفي يشير، هي مجموعة صغيرة من الخلايا الموجودة في قاعدة للغدة الليمفاوية والتي تكون بمثابة الجذعية تشبه الخلايا المتخصصة. العمل في وقت مبكر إنشاء الوظائف الحيوية للالشق 15-18 </suص>، القنفذ 19،20، JAK-STAT 18، والنشاط مجنح 21 لتنظيم تطوير الغدة الليمفاوية اليرقات. وقد أثبتت الدراسات الحديثة أن BMP 22، جمعية جيل المستقبل الراس 23، وفرس النهر 24،25 إشارات تعمل أيضا في الغدة الليمفاوية اليرقات.
أربعة فحوصات للدم اليرقات المذكورة هنا تصف 1) قياس تعميم تركيز كرية دموية، الذي يعرف بأنه عدد من الخلايا لكل وحدة حجم، 2) عزل وتحديد تعميم hemocytes لالمناعية، 3) تصور خلايا الكريستال في الجسم الحي، و4) تشريح، وتحديد، وتصاعد الغدد الليمفاوية المناعية. هذه المقايسات ويمكن استخدام قراءات للدم لتقييم الوظائف وأنظمة مسارات الإشارات في نظام المكونة للدم اليرقات. في حين استخدمت هذه الأساليب في السابق في هذا المجال، وقد بدأت وثائق بصرية من هذه المقايسات إلا في الآونة الأخيرة 8،26-30. العديد من المنشورات المذكورة هنا هي مساعدةالموارد فول تصف أساليب مماثلة وعلامات المكونة للدم 26،31-33. بالإضافة إلى ذلك، عجلا وفايكنغ هي علامات مفيدة للغشاء الليمفاوية الغدة الطابق السفلي.
Protocol
Representative Results
Discussion
على التعديل الوراثي أو البيئة، والطرق الأربعة الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم بشكل فردي أو بالاشتراك لتحليل العمليات متميزة خلال تكون الدم مثل الإشارات والبقاء والانتشار، والتمايز ذبابة الفاكهة تكون الدم هو عملية ديناميكية؛ عدد hemocytes لكل حيوان يزيد 35 و هيكل …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Matthew O’Connell, Maryam Jahanshahi, and Andreas Jenny for assistance. We thank István Andó for plasmatocyte-specific antibodies, Utpal Banerjee for dome-meso-EBFP2 flies, Julian Martinez-Agosto for antp>GFP flies, and Michael O’Connor for ptth and ptth>grim flies. These methods were developed with support by the Kimmel Foundation, the Leukemia & Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059, and NIH/NCI T32CA078207.
Materials
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
References
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
- Crozatier, M., Meister, M. Drosophila haematopoiesis. Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).
- Crozatier, M., Vincent, A. Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias. Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).
- Gold, K. S., Bruckner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
- Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response. Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. Elife. 4, (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier. PLoS Biol. 2 (8), 196 (2004).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Minakhina, S., Steward, R. Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes. Genetics. 174 (1), 253-263 (2006).
- Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation. EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).
- Avet-Rochex, A., et al. An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis. BMC Dev Biol. 10, 65 (2010).
- Rodriguez, A., et al. Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster. Genetics. 143 (2), 929-940 (1996).
- Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm. Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).
- Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm. Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).
- Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis. Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).
- Krzemien, J., et al. Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre. Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).
- Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors. Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).
- Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).
- Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila. Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).
- Pennetier, D., et al. Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).
- Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function. Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).
- Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis. Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).
- Milton, C. C., et al. The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster. Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).
- Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis. Methods. 68 (1), 242-251 (2014).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J Vis Exp. (63), e3347 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).
- Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).
- Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M. Properties of the Larval Hemocytes of Drosophila-Melanogaster. Experientia. 36 (10), 1223-1226 (1980).
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila. Dev Biol. 230 (2), 243-257 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila. Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).
- Reimels, T. A., Pfleger, C. M. Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis. J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).
