El protocolo proporciona una metodología para solubilizar lodo granular aeróbico con el fin de extraer los polímeros extracelulares de alginato-como (ALE).
To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na2CO3) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca2+). From the six extraction methods used, only the Na2CO3 extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca2+. The Ca2+-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.
En los últimos años, el proceso aerobio lodo granular (AGS) se ha convertido en un proceso de tratamiento biológico de aguas residuales popular, aplicado con éxito en varias plantas de tratamiento de aguas residuales a escala real 1. En contraste con el proceso de lodos activados convencional, en el proceso de los AGS los microorganismos forman gránulos en lugar de flóculos 2. Estos gránulos tienen mejor decantación, son capaces de soportar velocidades de carga orgánica más altas, y tienen una mayor tolerancia a la toxicidad de los flóculos de lodo activado 3.
A diferencia de las biopelículas, AGS se forma de manera espontánea y sin la participación de cualquier material de soporte 4. En AGS, como en biopelículas, los microorganismos producen una cantidad significativa de sustancias poliméricas extracelulares altamente hidratados (EPS) 5 para formar una matriz de hidrogel en la que son auto-inmovilizado 4-6. EPS son una mezcla compleja, que consta de polisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos, (phospho) lípidos, sustancias húmicas y algunos polímeros intercelulares 5,7,8. Estas sustancias poliméricas interactúan entre sí a través de fuerzas electrostáticas, enlaces de hidrógeno, fuerzas iónicas atractivos y / o reacciones bioquímicas, etc. 5, formando una estructura de red terciaria densa y compacta. Los polímeros en EPS que son capaces de formar hidrogeles 4,9 y contribuir a la formación de la estructura de la red terciaria son a este respecto considerado como EPS estructurales, un subconjunto de los EPS totales.
EPS son responsables de la estructura química y propiedades físicas de los gránulos 5. Por lo tanto, es crucial para entender la función de cada compuesto EPS. Diversos enfoques se aplican para extraer EPS 10-15. Sin embargo, debido a su extrema complejidad, es casi imposible de extraer todos los componentes del EPS por un solo método. Hasta la fecha, no existe una "talla única" método para la extracción de EPS. La elección del método de extracción influye no sólo la cantidad total, sino también la composición de los polímeros recuperados 13,16 – 20. Dependiendo del tipo de lodo y las ganancias por acción de interés diferentes métodos son obligatorios.
La extracción de los polímeros formadores de gel, la caracterización de sus propiedades y la investigación de sus interacciones con los demás y con EPS no formador de gel ayudará a revelar el papel de EPS en la formación de lodo granular aerobio. Además, los polímeros formadores de gel son también biopolímeros útiles en aplicaciones industriales. Una posible aplicación ya se demostró mediante el uso de polímeros formadores de gel de AGS como material de recubrimiento para aumentar la resistencia al agua de papel 21.
Por lo tanto, se necesitan métodos de extracción, específicos para EPS formadores de gel. El objetivo de este estudio es desarrollar una metodología para extraer EPS de formación de gel de AGS. Seis métodos de extracción 10 – 15,22, que se utilizan con frecuencia en la literatura, se seleccionaron para extraer EPS de la AGS. La cantidad total y la propiedad de formación de gel de la EPS extraídos se compararon para cada metodología.
Observaciones para el servicio de protocolo
La extracción de EPS / ALE se describe, por un volumen de 50 ml y 3 g de gránulos. Estos valores son guías. Extracciones con concentraciones más altas de los gránulos pueden disminuir el rendimiento de la EPS extraídos. Durante la extracción de ALE la temperatura debe mantenerse constante a 80 ° C durante 30 min. El tiempo requerido para la mezcla para calentar (alrededor de 5 min) se incluye en el protocolo. Además, la eficacia de extracción se mejora mediante el uso de una barra de agitación magnética de la mismo tamaño que el diámetro de la parte inferior del matraz. Esto dará lugar a buenas propiedades de mezcla y efectos de fresado, la promoción de la extracción de EPS.
Más adelante, en la sección de protocolo, se determinan TS y VS rendimientos de todas las extracciones (sobrenadante recogido en los pasos 1.1-1.6). La diálisis se debe realizar antes de la TS y VS medición para disminuir los posibles errores debido a la presencia de productos químicos utilizados para las extracciones. UNMWCO de 3.500 Da Se recomienda eliminar estas sustancias químicas al tiempo que conserva las macromoléculas EPS dentro de la bolsa de diálisis. La bolsa de diálisis debería tener un volumen mayor que el volumen del extracto. Esto es necesario, ya que el volumen del extracto se incrementará durante la diálisis (por ejemplo, para la extracción de EDTA hasta aumento de volumen 40%). El grado de eliminación química por diálisis se puede determinar midiendo el pH en la muestra antes y después de la diálisis. Alternativamente, las mediciones de conductividad del agua de diálisis muestran el grado de eliminación de iones.
Para obtener ALE de las EPS total extraído (pasos 1.6 y 2) la etapa de diálisis es opcional. Sin embargo, la diálisis tiene tres ventajas: reduce la cantidad de HCl necesaria para la precipitación, se mejora la transferencia de masa de ácido en el extracto y disminuye el contenido de cenizas de la ALE obtenido. Para la precipitación de ALE se recomienda usar un vaso de precipitados de vidrio con un volumen mucho mayor que la extract. Na 2 CO 3 sobredosis se presenta normalmente en la extracción. El HCl añadido será primero reaccionar con el Na 2 CO 3 dejó en el extracto, lo que resulta en la formación de dióxido de carbono y, si la muestra no se dializó antes, en la formación de espuma. Durante la adición del HCl, el extracto debe agitó lentamente con una barra de agitación magnética de el mismo tamaño que la parte inferior del vaso de precipitados. Una barra de agitación de este tamaño y agitación lenta dará lugar a una mezcla uniforme sin romper la estructura del precipitado. Si grumos de gel de ácidos se forman en el extracto, el vaso de precipitado debe ser agitado ligeramente con la mano. La precipitación se lleva a cabo con una concentración de ácido de 1 M de evitar un aumento de volumen grande del extracto mientras que todavía obtener una distribución homogénea del ácido en la muestra. las concentraciones de ácido más altas pueden dar lugar a una formación de disminución del pH regional y grumos de gel de ácidos. Un pH inferior a 2,0 disminuye la cantidad de ALE que se puede recuperar, probablemente debido a los cambios estructuralesde los polímeros a pH más bajo. Por tanto, es importante mantener el pH final en 2,20 ± 0,05.
limitaciones
El método de extracción ALE pretende extraer polímeros extracelulares estructurales de las EPS desde AGS o biopelículas en general y no tiene la intención de extraer todas las EPS presentes. Para extraer todos EPS, una combinación de más de un método de extracción es necesario. Por otra parte, como se muestra con el aumento del rendimiento VS EPS mediante la aplicación de una extracción doble y cuádruple, una sola extracción no extraer todos EPS estructurales. extracción ALE es un método de extracción EPS duro, la combinación de mezcla constante con las condiciones de calor y alcalinas. Por esta razón es posible que un poco de material intracelular se extrae junto con los EPS. Aunque la lisis celular puede ser causada por técnicas de extracción física y química (tratamiento con ultrasonidos, 31,32 NaOH 31,32, 11,32 EDTA, CER 32, 32 de calor y de alto cizallamiento tasas por mijación 19), la presencia de material intracelular en EPS recuperadas todavía tiene que ser verificado. La propiedad iónica de formación de gel de la EPS extraídos es el foco principal de esta investigación, si la EPS recuperada contiene material intracelular no fue analizado. La investigación futura se centrará en la identificación de material intracelular en la EPS extraídos.
Solubilización de la matriz de hidrogel de AGS es crucial para extraer EPS estructurales
EPS forma una matriz de hidrogel denso y compacto en AGS. Aunque EPS contiene diversas clases de macromoléculas orgánicas, tales como polisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos, lípidos (fosfo), sustancias húmicas y algunos polímeros intercelulares 7,5,8, no todos ellos formar un gel. Sólo aquellos polímeros formadores de gel se consideran aquí como polímeros estructurales en EPS.
El objetivo de EPS extracciones es para solubilizar primera EPS y luego para recoger las EPS solubilizadas. Si la EPS estructurales (es decir, tél EPS formar un hidrogel) es el objetivo de la extracción, la matriz de gel de AGS tiene que solubilizarse primero. Sólo los métodos que pueden solubilizar la matriz de gel son capaces de extraer EPS estructurales. En esta investigación, algunos utilizan con frecuencia EPS métodos de extracción tales como centrifugación de 10 – 15, 10,14,15 sonicación, EDTA 10 – 12,14,15, formaldehído + NaOH al 10 – 15 y el formamida + NaOH 13 no pudieron aislar eficazmente el estructural EPS. Esto es debido al hecho de que la matriz de hidrogel de los gránulos aerobios no se solubilizó mediante estos métodos. Por esta razón, las pruebas de estabilidad en la sección 4 solamente se realizaron con las condiciones actuales de EDTA, formamida NaOH + y + formaldehído extracción de NaOH. Estos tres extracciones no eran capaces de aislar EPS estructurales, pero aún así obtener el mayor rendimiento VS EPS además de la Na 2 CO 3 de extracción. condiciones of Na 2 CO extracción 3 no se aplica ya que este método de extracción claramente solubilizan la matriz AGS. De ahí que las condiciones aplicadas durante la prueba de estabilidad se consideraron representativas.
La extracción con resina de intercambio catiónico (CER), otro método de extracción EPS utilizado con frecuencia, no se consideró para esta comparación, ya que los estudios anteriores sobre la extracción de EPS con CER no dió mejores resultados que las extracciones químicas que se utilizan aquí.
Gel de formación de EPS en AGS
EPS formadores de gel son considerados como los EPS estructurales en la matriz de hidrogel de AGS. Vale la pena señalar que hay varios tipos de hidrogeles tales como geles iónicos, geles inducidos por la temperatura y geles pH inducidos. Este estudio sólo se centra en EPS que forman geles iónicos. En cuanto a la gran fracción de material de gel estructural extraídos, esto es probable que sean los EPS estructurales dominantes. Es cierto que hay posibilidades de que otros tipos de EPSque forma diferentes tipos de hidrogeles (gel inducida por ejemplo, pH 28) existe en el mismo u otro tipo de gránulos aerobios. Sin embargo, no importa qué tipo de hidrogel se dirige, la solubilización de la matriz de gel de EPS es el paso más importante para extraer EPS formadores de gel.
Actualmente, la investigación se ha realizado sobre EPS estructurales de lodo granular. La extracción ALE se describe en este protocolo es capaz de extraer EPS de formación de gel de AGS y se utilizará en futuros estudios para caracterizar EPS estructurales. Más investigación que hay que hacer en AGS, EPS EPS estructurales y no estructurales para comprender mejor el proceso y la función de granulación y EPS. Especialmente los tres puntos siguientes deben ser investigados: ¿por qué microorganismos producen una cantidad tan grande de EPS, ¿cuál es la composición exacta de EPS y cómo es la composición de EPS modificado en función de los cambios ambientales. Detección y análisis de todos los compuestos involucrados y sus interactions ayudará a entender las biopelículas y la forma de utilizarlos a nuestro favor.
The authors have nothing to disclose.
This research was financially supported by the SIAM Gravitation Grant 024.002.002, the Netherlands Organization for Scientific Research and by the Dutch Technology Foundation (STW – Simon Stevin Meester 2013). The authors want to thank Mario Pronk for providing the granular sludge samples.
250 ml baffled flask | Kimble | 25630-250 | |
1000 ml glass beaker | VWR | 213-1128 | |
RCT basic, magnetic stirrer with thermometer | IKA | 3810000 | |
sodium carbonate decahydrate | Merck KGaA | 1063911000 | |
50 ml centrifugation tubes | greiner bio-one | 227261 | |
Multifuge 1 S-R, centrifuge | Heraeus/Thermo Scientific | – | |
hydrochloric acid, 37 % | Sigma-Aldrich | 30721-1L-GL-D | |
250 ml glass beaker | VWR | 213-1124 | |
calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 1023821000 | |
1 ml Pasteur Pipette | Copan | 201C |