Протокол обеспечивает методологию солюбилизировать аэробную из гранулированного ила с целью извлечения альгинатлиазной как внеклеточные полимеры (ALE).
To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na2CO3) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca2+). From the six extraction methods used, only the Na2CO3 extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca2+. The Ca2+-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.
В последние годы аэробные гранулированный шлам процесс (AGS) стал популярным биологический процесс очистки сточных вод, успешно применяется на нескольких полномасштабных очистных сооружений 1. В отличие от обычного процесса с активным илом в АГС обрабатывать микроорганизмы образуют гранулы вместо флокенов 2. Эти гранулы имеют более осаждаемость, способны выдерживать более высокие скорости загрузки органических, и имеют более высокую толерантность к токсичности по сравнению с активированными хлопьями осадка 3.
В отличие от биопленок, АГС формируется спонтанно , без участия какого – либо материала – носителя 4. В АГС, как и в биопленок, микроорганизмы продуцируют значительное количество высоко гидратированных внеклеточных полимерных веществ (EPS) 5 с образованием матрицы из гидрогеля , в котором они себя иммобилизованные 4 – 6. EPS представляют собой сложную смесь, состоящую из полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот, (phospхо) липиды, гуминовые вещества и некоторые межклеточные полимеры 5,7,8. Эти полимерные вещества взаимодействуют друг с другом с помощью электростатических сил, водородных связей, привлекательных ионных сил и / или биохимических реакций и т.д. 5, образуя плотный и компактный третичную структуру сети. Полимеры в СЭП , которые способны образовывать гидрогели и 4,9 вносят вклад в формирование третичной структуры сети в этом отношении рассматриваемого в качестве структурных ЭПС, подмножестве общего числа EPS.
EPS отвечают за химической структуры и физических свойств гранул 5. Поэтому крайне важно, чтобы понять функции каждого соединения EPS. Различные подходы применяются для извлечения EPS 10 – 15. Тем не менее, из-за их чрезвычайной сложности, практически невозможно извлечь все компоненты EPS одним единственным способом. На сегодняшний день не существует "один размер подходит всем" метод для извлечения EPS, Выбор метода экстракции влияет не только общее количество, но и состав извлекаемых полимеров 13,16 – 20. В зависимости от типа ила и EPS процентных различных методов необходимы.
Распаковка гелеобразующих полимеров, характеризующие их свойства и исследовать их взаимодействие друг с другом и с не-гелеобразующих EPS поможет выявить роль ЭПС в формировании аэробной из гранулированного ила. Кроме того, гелеобразующие полимеры также являются полезными биополимеров в промышленных применениях. Одним из возможных применений уже было показано с использованием гелеобразующих полимеров из АГС в качестве материала покрытия для повышения влагостойкости бумаги 21.
Поэтому необходимы методы экстракции, специфические для гелеобразующих EPS. Целью данного исследования является разработка методологии для извлечения гелеобразующих EPS из АГС. Шесть способов экстракции 10 – 15,22, которые часто используются в литературе, были выбраны для извлечения EPS из АГС. Общее количество и гелеобразующих свойство экстрагированных EPS сравнивались для каждой методологии.
Примечания для секции протокола
Экстракцию EPS / ALE описывается для объема 50 мл и 3 г гранул. Эти значения предназначены в качестве руководства. Экстрагирование с более высокими концентрациями гранулами могут уменьшить выход извлекаемых EPS. Во время экстракции эля температура должна поддерживаться постоянной при 80 ° С в течение 30 мин. Время, необходимое для смеси для нагрева (около 5 мин) включается в протокол. Более того, эффективность экстракции усиливается с помощью магнитной мешалки одного и того же размера, что и диаметр дна горшка. Это приведет к хорошим свойствам смешиванию и измельчению эффектов, способствуя извлечению EPS.
Позже в разделе протокола, TS и VS выходы всех извлечений (супернатант собирали с шагом 1,1-1,6) определяются. Диализ должна быть выполнена перед TS и VS измерения, чтобы уменьшить возможные ошибки из-за наличия химических веществ, используемых для экстрагирования.MWCO 3500 Da рекомендуется удалить эти химические вещества, сохраняя при этом макромолекулы EPS внутри диализного мешка. Мешок диализ должен иметь больший объем, чем объем экстракта. Это необходимо, так как объем экстракта будет увеличиваться во время диализа (например, для экстракции ЭДТА до 40% увеличения объема). Степень химического удаления путем диализа может быть определено путем измерения рН в образце до и после диализа. В качестве альтернативы, измерения электропроводности диализной воды показывают степень удаления ионов.
Чтобы получить ALE от всего добываемого EPS (шаги 1.6 и 2) стадию диализ не является обязательным. Тем не менее, диализ имеет три преимущества: она уменьшает количество HCl, необходимое для осаждения, она улучшает передачу кислоты массы в экстракте и уменьшает содержание золы полученного эля. Для осаждения ALE рекомендуется использовать стеклянную мензурку с гораздо большим объемом, чем Extracт. Na 2 CO 3 , как правило , передозировка при экстракции. Добавленное HCl , сначала вступают в реакцию с Na 2 CO 3 осталось в экстракте, что приводит к образованию диоксида углерода , и, если образец не подвергали диализу до того , в вспенивание. Во время добавления HCl, экстракт следует медленно перемешивают магнитной мешалкой того же размера, что и в нижней части стакана. Перемешивающим стержнем такого размера и медленном перемешивании приводит к равномерному смешиванию, не нарушая структуру осадка. Если кислотные комки гель образуются в экстракте, химический стакан должен быть слегка вращают рукой. Осаждение проводят при концентрации кислоты 1 М, чтобы избежать значительного увеличения объема экстракта в то же время получения однородного распределения кислоты в образце. Более высокие концентрации кислот могут привести к образованию регионального снижения рН и кислотные гелевые комки. Значение рН ниже 2,0 уменьшает количество ALE, которые могут быть восстановлены, вероятно, из-за структурных измененийиз полимеров при более низком рН. Поэтому очень важно, чтобы сохранить конечный рН на уровне 2,20 ± 0,05.
Ограничения
Метод экстракции ALE имеет целью извлечения структурных внеклеточные полимеры ЭПС из АГС или биопленки в целом и не предназначен для извлечения всех присутствующих EPS. Чтобы извлечь все EPS, сочетание нескольких методов экстракции необходимо. К тому же , как показано с увеличением выхода VS EPS путем применения двойной и четверной экстракции, одна экстракция будет не извлечь все структурные EPS. Извлечение ALE суровая метод извлечения EPS, сочетая постоянное перемешивание с помощью тепловых и щелочных условиях. По этой причине, возможно, что некоторые внутриклеточный материал экстрагируют вместе с EPS. Хотя лизис клеток может быть вызвана с помощью методов физической и химической экстракции (озвучивания 31,32, 31,32 NaOH, ЭДТА 11,32, CER 32, 32 тепла и высокой скорости сдвига на тixing 19), наличие внутриклеточного материала в извлекаемых EPS еще должна быть проверена. Ионный гелеобразующих свойство добытых EPS является основным направлением данного исследования, содержит ли восстановленный EPS внутриклеточный материал не был проанализирован. Будущие исследования будут сосредоточены на выявлении внутриклеточный материал в извлеченном EPS.
Солюбилизации гидрогеля матрицу AGS имеет решающее значение для извлечения структурных EPS
EPS образует плотные и компактные матричные гидрогель в AGS. Несмотря на то, EPS содержит различные классы органических макромолекул , таких как полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты, (фосфо) липидов, гуминовых веществ и некоторых внутриклеточных полимеров 7,5,8, не все они образуют гель. Только те гелеобразующие полимеры, рассматриваются здесь в качестве конструкционных полимеров в EPS.
Целью EPS извлечений является сначала растворять EPS, а затем собрать растворенные EPS. Если структурные EPS (то есть, тон EPS образует гидрогель) является целью экстракции, матрица гель АГС должен быть растворены в первую очередь. Только методы, которые могут растворять гелевой матрицы способны извлекать структурные EPS. В этом исследовании, некоторые часто используемые EPS методы экстракции , например центрифугирования 10 – 15, озвучивания 10,14,15, ЭДТА 10 – 12,14,15, формальдегид + NaOH 10 – 15 и формамида + NaOH 13 не может эффективно изолировать структурный EPS. Это связано с тем, что гидрогель матрица аэробных гранул не солюбилизировалось этими методами. По этой причине, тесты на стабильность в разделе 4 были выполнены только с условиями в настоящее время ЭДТА, формамид + NaOH и формальдегида + экстракции NaOH. Эти три извлечений не были способны изолировать структурные EPS, но до сих пор получили самый высокий выход VS EPS помимо Na 2 CO 3 экстракции. условия выводае извлечение Na 2 CO 3 не применялись в качестве этого способа экстракции четко солюбилизированного матрицу AGS. Поэтому применяемые условия во время испытания на стабильность были считаться репрезентативными.
Экстракция с катионообменной смолой (ЦЭИ), другой часто используемый метод экстракции EPS, не рассматривалась для этого сравнения, как и предыдущие исследования по извлечению прибыли на акцию с CER не дают лучшие результаты, чем химических извлечений, используемых здесь.
Гелеобразующего EPS в AGS
Гелеобразующего EPS рассматриваются как структурные EPS в гидрогеле матрице AGS. Стоит отметить, что существуют различные виды гидрогели, такие как ионные гели, температурно-индуцированное гелей и рН индуцированных гелей. Это исследование фокусируется только на EPS, которые образуют ионные гели. Что касается большой фракции структурного материала геля, извлеченной, это, вероятно, будет доминирующим структурных EPS. Есть, конечно, возможности, что и другие виды EPSкоторые представляют собой разные виды гидрогели (например, рН индуцированный гель 28) существует в том же или другом типе аэробных гранул. Тем не менее, независимо от того, какой гидрогель не предназначен, растворяющие матрица EPS гель является самым важным шагом для извлечения гелеобразующих EPS.
В настоящее время мало исследований было сделано на структурных EPS зернистого шлама. Экстракцию ALE описано в данном протоколе способен извлекать гелеобразующих EPS из AGS и будет использоваться в будущих исследованиях для характеристики структурных EPS. Необходимы дополнительные исследования должно быть сделано на АГС, структурных EPS и ненесущих EPS, чтобы лучше понять процесс и функции грануляции и EPS. Особенно следующие три точки должны быть исследованы: почему микроорганизмы производят такое большое количество EPS, каков точный состав EPS и как состав EPS модифицировать в зависимости от изменений окружающей среды. Обнаружение и анализ всех вовлеченных соединений и их interactiДополнения поможет понять биопленки и как использовать их в своих интересах.
The authors have nothing to disclose.
This research was financially supported by the SIAM Gravitation Grant 024.002.002, the Netherlands Organization for Scientific Research and by the Dutch Technology Foundation (STW – Simon Stevin Meester 2013). The authors want to thank Mario Pronk for providing the granular sludge samples.
250 ml baffled flask | Kimble | 25630-250 | |
1000 ml glass beaker | VWR | 213-1128 | |
RCT basic, magnetic stirrer with thermometer | IKA | 3810000 | |
sodium carbonate decahydrate | Merck KGaA | 1063911000 | |
50 ml centrifugation tubes | greiner bio-one | 227261 | |
Multifuge 1 S-R, centrifuge | Heraeus/Thermo Scientific | – | |
hydrochloric acid, 37 % | Sigma-Aldrich | 30721-1L-GL-D | |
250 ml glass beaker | VWR | 213-1124 | |
calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 1023821000 | |
1 ml Pasteur Pipette | Copan | 201C |