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Environment

Estrazione di sostanze strutturale extracellulare polimerici da aerobico granulare fanghi

Published: September 26, 2016
doi:
10.3791/54534
, , , ,
1Department of Biotechnology,Delft University of Technology, 2Department of Biotechnology, Norwegian Biopolymer Laboratory (NOBIPOL),Norwegian University of Science and Technology

Summary

Il protocollo prevede una metodologia per solubilizzare fango granulare aerobico per estrarre polimeri extracellulari alginato-like (ALE).

Abstract

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na2CO3) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca2+). From the six extraction methods used, only the Na2CO3 extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca2+. The Ca2+-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.

Introduction

Negli ultimi anni il processo di fango granulare (AGS) aerobico è diventato un popolare processo di trattamento biologico delle acque reflue, applicato con successo in diverse su larga scala impianti di depurazione 1. In contrasto con il processo a fanghi attivi convenzionali, elaborano i AGS microrganismi formano granuli invece di fiocchi 2. Questi granuli hanno una migliore sedimentazione, sono in grado di resistere a più alti tassi di carico organico, e hanno una maggiore tolleranza alla tossicità di fiocchi fanghi attivi 3.

A differenza di biofilm, AGS si forma spontaneamente senza il coinvolgimento di qualsiasi materiale di supporto 4. In AGS, come in biofilm, microorganismi producono una notevole quantità di sostanze polimeriche extracellulari altamente idratati (EPS) 5 per formare una matrice idrogel in cui sono auto-immobilizzato 4 – 6. EPS sono una miscela complessa, costituita da polisaccaridi, proteine, acidi nucleici, (phospHo) lipidi, sostanze umiche ed alcuni polimeri intercellulari 5,7,8. Queste sostanze polimeriche interagiscono tra loro mediante forze elettrostatiche, legami idrogeno, forze ioniche attraenti e / o reazioni biochimiche, ecc 5, formando una struttura di rete terziaria densa e compatta. I polimeri in EPS che sono in grado di formare idrogeli 4,9 e contribuire alla formazione della struttura di rete terziaria sono a questo riguardo considerato EPS strutturali, un sottoinsieme del totale EPS.

EPS sono responsabili della struttura chimica e proprietà fisiche dei granuli 5. E 'quindi fondamentale per capire la funzione di ogni composto EPS. Vari approcci sono applicati per estrarre EPS 10 – 15. Tuttavia, a causa della loro estrema complessità, è quasi impossibile estrarre tutti i componenti EPS da un unico metodo. Ad oggi, non vi è "one size fits all" metodo di estrazione EPS. La scelta del metodo di estrazione influenza non solo la quantità totale, ma anche la composizione dei polimeri recuperati 13,16 – 20. A seconda del tipo di fanghi e le EPS di interesse metodi differenti sono necessari.

Estrazione polimeri gelificanti, caratterizzano le loro proprietà e indagare le loro interazioni con l'altro e con EPS non-gelificanti contribuirà a rivelare il ruolo di EPS in formazione di fango aerobico granulare. Inoltre, i polimeri gelificanti sono anche biopolimeri utili in applicazioni industriali. Una possibile applicazione è stato già dimostrato utilizzando polimeri gelificanti da AGS come materiale di rivestimento per aumentare la resistenza all'acqua di carta 21.

Pertanto, sono necessari metodi di estrazione, specifici per EPS gelificanti. Lo scopo di questo studio è quello di sviluppare una metodologia per estrarre EPS gelificanti da AGS. Sei metodi di estrazione 10 – 15,22, che sono spesso utilizzati in letteratura, sono stati selezionati per estrarre EPS da AGS. L'importo totale e la struttura gelificante dell'EPS estratti sono stati confrontati per ciascuna metodologia.

Protocol

NOTA: AGS sono stati raccolti dal reattore pilota Nereda presso l'impianto di trattamento delle acque reflue Utrecht, Paesi Bassi. Il reattore è stato alimentato con depurazione comunale. Il fango granulare aveva un indice di volume dei fanghi (SVI 5min) di 59,5 ml / g VSS. Il fango è stato campionato in aprile alla fine di un ciclo aerobico. Dopo il campionamento, il fango è stato immediatamente trasportato al laboratorio, setacciato e conservato a -20 ° C fino al momento dell'uso. 1. Estrazione EPS NOTA: fango granulare Centrifugare a 4.000 × g e 4 ° C per 20 minuti, e decantare il surnatante. Raccogliere granuli nel pellet per le estrazioni. I solidi totali (TS) e solidi volatili (VS) dei granuli sono state determinate mediante i metodi standard 23. Il fattore di conversione tra granuli peso umido – il peso dei granuli prelevati direttamente dal pellet – e TS è stato determinato prima della estrazione. Tutte le estrazioni sono stati fatti in triplicato. NOTA: 3 g g bagnatoranules sono stati utilizzati per ogni metodo di estrazione. I loro TS e valori VS (0,39 g TS e 0,34 g VS), misurato in triplicato, sono stati usati per calcolare il rendimento di estrazione. Estrazione centrifugazione 11 Trasferimento 3 g (peso umido) di granuli in un tubo di centrifugazione e riempire il tubo di centrifugazione a 50 ml con acqua demineralizzata. Un po 'scuotere il tubo di centrifugazione a mano. Centrifugare il tubo di centrifugazione contenente la miscela a 4.000 × g e 4 ° C per 20 min. Raccogliere il surnatante in un bicchiere di vetro, scartare il pellet e continuare con il surnatante come descritto nella sezione 1.7. Estrazione Sonicazione 10 Trasferimento 3 g (peso umido) di granuli in un tubo di centrifugazione e riempire il tubo di centrifugazione a 50 ml con acqua demineralizzata. Applicare sonicazione pulsata in ghiaccio per 2,5 min a 40 W alla miscela. Centrifugare la centrifugazioneprovetta contenente la miscela a 4.000 × g e 4 ° C per 20 min. Raccogliere il surnatante in un bicchiere di vetro, scartare il pellet e continuare con il surnatante come descritto nella sezione 1.7. L'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) di estrazione 11 Trasferimento 3 g (peso umido) di granuli in una bottiglia di vetro da 100 ml e riempire la bottiglia a 50 ml con 2% (w / v) di EDTA. Leggermente agitare il flacone a mano e conservare in frigorifero a 4 ° C per 3 ore. Trasferire il composto in un tubo di centrifugazione 50 ml. Centrifugare il tubo di centrifugazione contenente la miscela a 4.000 × g e 4 ° C per 20 min. Raccogliere il surnatante in un bicchiere di vetro, scartare il pellet e continuare con il surnatante come descritto nella sezione 1.7. Formamide – Estrazione di idrossido di sodio (NaOH) 13 Trasferimento 3 g (peso umido) di granuli in un 100bottiglia di vetro ml e riempire la bottiglia a 50 ml con acqua demineralizzata. Aggiungere 0,3 ml 99% formammide. Leggermente agitare il flacone a mano e conservare in frigorifero a 4 ° C per 1 ora. Aggiungere 20 ml di 1 M NaOH alla sospensione granuli. Leggermente agitare il flacone a mano e conservare in frigorifero a 4 ° C per 3 ore. Trasferire il composto in modo uniforme in due da 50 ml tubo di centrifugazione. Centrifugare le provette centrifugazione contenenti la miscela a 4.000 × g e 4 ° C per 20 min. Raccogliere il surnatante in un bicchiere di vetro, scartare il pellet e continuare con il surnatante come descritto nella sezione 1.7. Estrazione di NaOH 11 – Formaldeide Trasferimento 3 g (peso umido) di granuli in una bottiglia di vetro da 100 ml e riempire la bottiglia a 50 ml con acqua demineralizzata. Aggiungere 0,3 ml di 37% di formaldeide. Un po 'agitare la bottiglia a mano e negozioin frigorifero a 4 ° C per 1 ora. Aggiungere 20 ml di 1 M NaOH alla sospensione granuli. Leggermente agitare il flacone a mano e conservare in frigorifero a 4 ° C per 3 ore. Trasferire il composto in modo uniforme in due da 50 ml tubo di centrifugazione. Centrifugare le provette centrifugazione contenenti la miscela a 4.000 × g e 4 ° C per 20 min. Raccogliere il surnatante in un bicchiere di vetro, scartare il pellet e continuare con il surnatante come descritto nella sezione 1.7. Alta temperatura – estrazione di carbonato di sodio (Na 2 CO 3) 9,22,24 Preriscaldamento 150 ml acqua di rubinetto in un bicchiere di vetro 1000 ml su un agitatore magnetico a 80 ° C. Trasferimento 3 g (peso umido) di granuli in un pallone da 250 ml sconcertato e riempire il pallone a 50 ml con acqua demineralizzata. Aggiungere 0,25 g di Na 2 CO 3 anidro o 0,67 g di Na 2 CO 3 • 10H <sub> 2 O nel pallone per ottenere un 0.5% (w / v) Na 2 CO 3 concentrazione. Mettere il pallone contenente la miscela nella vasca d'acqua. Coprire il pallone e il vetro becher separatamente con foglio di alluminio per evitare l'evaporazione. Mescolare la miscela per 35 min a 400 rpm a 80 ° C. Trasferire il composto in un tubo di centrifugazione 50 ml. Centrifugare il tubo di centrifugazione contenente la miscela a 4.000 × g e 4 ° C per 20 min. Raccogliere il surnatante e scartare il pellet. TS e VS misura di tutti gli estratti secondo i metodi standard 23. Prendere il surnatante e dializzare per 24 ore contro le 1.000 ml di acqua ultrapura (sacchetto di dialisi con peso molecolare 3.500 Da tagliare (MWCO)) 11,12. Cambiare l'acqua di dialisi dopo 12 ore per aumentare l'effetto della dialisi. Trasferire una frazione ragionevole (circa 1/3) del surnatante dializzato perun piatto di alluminio per TS e VS di misura 23. NOTA: Asciugare il campione durante la notte a 105 ° C. La differenza di peso della capsula di alluminio vuota e il piatto di alluminio contenente il campione essiccato è il contenuto TS. Poi bruciare lo stesso piatto di alluminio contenente il campione a 550 ° C per 2 ore. La differenza di peso tra il piatto di alluminio vuota e il piatto di alluminio contenente il campione bruciato è il contenuto di ceneri. La differenza tra il contenuto di TS e cenere è il contenuto VS. Per ogni estratto, trasferire la frazione residua del surnatante dializzato di 10 bicchieri di vetro ml. Addensare il supernatante per 2 giorni a 60 ° C fino ad un volume finale di 1-2 ml per aumentare la concentrazione del polimero nel surnatante. 2. alginato come extracellulare Polymer (ALE) Estrazione Dializzare l'estratto ottenuto al punto 1.6.8 in base al punto 1.7.1. Trasferire l'estratto dializzato in un bicchiere di vetro da 250 ml. Lentoly mescolare l'estrazione a 100 rpm e la temperatura ambiente. monitorare costantemente variazioni di pH con un elettrodo di pH, mentre l'aggiunta di 1 M di acido cloridrico (HCl) ad un pH finale di 2,2 ± 0,05 per ottenere ALE in forma acida. Dopo aver regolato il pH a 2,2, trasferire l'estratto in un tubo da 50 ml centrifugazione e centrifugare a 4000 xg e 4 ° C per 20 min. Eliminare il surnatante e raccogliere il pellet gel. Il pellet gel-like è ALE in forma acida. Per ottenere il sodio (o potassio) forma di ALE, aggiungere lentamente 0,5 M NaOH (o 0,5 M di idrossido di potassio) per il gel ottenuto nello stadio 2.4, durante la miscelazione del gel lentamente con una bacchetta di vetro a mano fino a raggiungere pH 8,5. 3. ionica Hydrogel test Formazione NOTA: Al fine di verificare se l'EPS estratti avevano ionici proprietà di formazione idrogel, un test di formazione tallone con ioni Ca 2+ è stato utilizzato 25. Dopo ispessimento della estratto nel passo 1.7.3 perun volume di 1-2 ml, mescolare lentamente la miscela con una bacchetta di vetro e regolare il pH a 8,5 con 0,5 M NaOH. Prendere l'estratto del punto 3.1 o ALE sodio passo 2.5 e gocciolare lentamente dell'estratto con una pipetta Pasteur in 2,5% (w / v) di cloruro di calcio (CaCl 2) soluzione. NOTA: Se l'EPS estratto ha gel idrogel ionica formando proprietà, a forma di goccia sarà formato (sferici) perline. Se l'EPS estratto ha gel idrogel ionica formando proprietà, l'estratto si disperderà nella soluzione di CaCl 2. 4. Prova di stabilità del ionica Hydrogel NOTA: Per comprendere meglio il ruolo dell'idrogel EPS ionici nella formazione della struttura AGS, prove di stabilità sono state effettuate sulle perline idrogel ionici del Na 2 CO 3 estrazione, raccolti nel passaggio 3.2. Mantenere le perline idrogel per 30 minuti nella soluzione di CaCl 2. Utilizzare un cucchiaio per togliere le perle di idrogel dal CaCl 2 </sub> soluzione e dividere le perline in quattro frazioni uguali. Conservare frazione 1 in 10 ml di acqua demineralizzata per 4 ore a 4 ° C. Le seguenti prove di stabilità sono state eseguite nello stesso modo come descritto nei metodi di estrazione 1.3 – 1.5. frazione negozio 2 in 10 ml 2% (w / v) di EDTA per 3 ore a 4 ° C. Conservare frazione 3 a 7,15 ml di acqua demineralizzata con 60 microlitri 99% formammide per 1 ora a 4 ° C. Quindi aggiungere 2,85 ml 1 M NaOH e frazione memoria 3 per 3 ore a 4 ° C. Conservare frazione 4 in 7,15 ml di acqua demineralizzata con 60 microlitri 37% di formaldeide per 1 ora a 4 ° C. Quindi aggiungere 2,85 ml 1 M NaOH e frazione deposito 4 per 3 ore a 4 ° C. Monitorare se c'è disgregazione visibile delle perline durante la conservazione, nelle condizioni descritte ai punti 4.3 – 4.6 a valutare se le perline resistere alle condizioni di estrazione.

Representative Results

estrazione EPS La comparsa dei granuli dopo l'applicazione di differenti procedure di estrazione EPS è mostrato in Figura 1. La struttura forma e gel di granuli era intatto dopo centrifugazione (Figura 1a) ed estrazione EDTA (figura 1c). Granuli erano rotte in frammenti di dimensioni diverse per sonicazione. La torbidità in fase liquida potrebbe essere dovuto alla sospensione di piccoli frammenti (Figura 1b) come torbidità altamente diminuita dopo centrifugazione. Formammide e formaldeide da sola non ha avuto alcun impatto sul cambiando la forma del granulo e la sua struttura gel (dati non mostrati). Dopo l'aggiunta di NaOH, la fase liquida attivata giallastro. Alcuni materiali soffici stato staccato dalla superficie dei granuli e formò un livello sopra granuli costante (Figura 1D e 1E). Tuttavia, la forma delgranuli non è stato modificato. L'aggiunta di NaOH apparentemente migliorata EPS solubilizzazione, ma non potrebbe danneggiare la struttura della matrice di gel. In confronto, granuli completamente scomparse dopo Na 2 CO 3 di estrazione (Figura 1F). Invece sono formate una miscela di particelle gelatinose liquidi e minuscole sol-like, che mostra la matrice di gel di granuli era effettivamente solubilizzati. Figura 1. aerobici fango granulare EPS estrazioni. Per una migliore visualizzazione dell'impatto di ciascun metodo di estrazione sui granuli, esperimenti sono stati condotti in 25 ml bottiglie di vetro. Dopo la procedura di estrazione, gli estratti sono stati conservati per 1 ora a temperatura ambiente per permettere la materia sospesa sedimenti. (A) estrazione di centrifugazione, (b) estrazione sonicazione, (c) estrazione EDTA, (d) Formamide – NaOH supplementarection, (e) Formaldeide – estrazione di NaOH, (f) ad alta temperatura -. Na 2 CO 3 estrazione Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. EPS resa rispetto alla frazione VS per ogni metodo è illustrato nella figura 2. La resa è presentato in mg VS EPS per g iniziale VS granuli. La quantità di EPS ottenuti con formaldeide + NaOH, formammide + NaOH e Na 2 CO 3 + calore + miscelazione sia superiore a quella di centrifugazione, sonicazione ed estrazione EDTA. Risultati simili a queste tecniche di estrazione sono stati mostrati anche da studi precedenti 11 – 13,15 indicano che le condizioni alcaline migliorare EPS solubilità 26,27. La quantità di EPS recuperato Na 2 CO 3 era il più alto, più di 20 volte di quello ottenuto soltanto per centrifugazione. Inoltre, la resa EPS totale di Na 2 CO 3 estrazione può essere ulteriormente migliorata da più estrazioni. A seconda estrazione utilizzando il pellet scartati in fase 1.6.8 (sezione protocollo) della prima dell'estrazione aumentata la resa totale del 28%, estrazione quadrupla anche aumentato il rendimento complessivo del 46%. Figura 2. I risultati di tutti i metodi di estrazione rispetto al VS resa e contenuto di ceneri. Per ogni estrazione la prima barra rappresenta la resa VS in mg VS EPS per g iniziale VS granuli. La seconda barra rappresenta la percentuale in peso di cenere nella ST estratti. Le barre di errore illustrano la deviazione standard dei tre estratti ottenuti per ogni tecnica di estrazione."_blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Alginato-like polimero extracellulare (ALE) di estrazione Dopo il pH delle EPS estratti con Na 2 CO 3 estrazione è stata regolata a 2,2, 63% del totale VS è stato precipitato. Il precipitato è ALE acida 25. La frazione residua é EPS che possono essere solubilizzata nelle condizioni di estrazione, ma non può formare un precipitato a pH 2.2. Test di formazione ionica idrogel granuli aerobici sono stati descritti come simile ad un idrogel. Il processo di granulazione è stato considerato come un fenomeno gelificante con glicosidi come agente gelificante 4,9,25,28. Normalmente, Ca 2+ è uno dei cationi più comuni nelle acque reflue. Inoltre, si lega facilmente con polisaccaridi acidi (ad esempio,alginati e acido poli-galatturonico), presumibilmente come una contro-ioni a mediare gelificazione 29. Così risultante in un idrogel ionicamente reticolato. È stato osservato che l'aggiunta di ioni Ca 2+ può accelerare fanghi aerobici granulazione 30. Pertanto, Ca 2+ ENV (idrogel ionici) potrebbe svolgere un ruolo importante nella costruzione della struttura a matrice gel in fango granulare aerobico. A questo proposito, se i EPS estratti forma un idrogel ionico con ioni Ca 2+ potrebbe essere utilizzato come un test per verificare se l'EPS estratto è un polimero strutturale contribuendo alla formazione della matrice gel in fango granulare aerobico 9. In questa ricerca, per l'EPS estratti da AGS (Figura 3a) con vari metodi, solo le EPS estratti con Na 2 CO 3 svolgono la forma di una goccia in 2.5% (w / v) CaCl soluzione 2 e ha formato stabili perline idrogel ionici .Inoltre, l'ALE sodio ottenuto da questa EPS da operazioni aggiuntive (ALE estrazione polimero, figura 3b) visualizzata la stessa proprietà pure. Il colore e la morfologia delle Ca 2+ perline gel -ALE (Figura 3c) sono simili a fango granulare aerobico (Figura 3a). Apparentemente, l'EPS estratti con il metodo Na 2 CO 3 contribuisce alla formazione della matrice gel in fango granulare aerobico. ALE, che è un componente principale di questa EPS sono polimeri strutturali, in grado di formare un idrogel ionici. Test di stabilità dell'idrogel ionica È stato osservato che durante l'estrazione EPS, granuli aerobici mantenuto la loro forma sferica in EDTA, formaldeide + NaOH e formamide + NaOH (Figura 1). Per capire se i polimeri strutturali estratti svolgono un ruolo nella stabilità dei granuli, Ca 2+ -ALE perline eranotrattati esattamente come granuli aerobici durante l'estrazione. È interessante notare che, Ca 2+ perline -ALE visualizzate le stabilità simile a quello di AGS (Figura 3d – 3F), vale a dire, Ca 2+ -ALE perline erano estremamente stabile in EDTA. C'era poca quantità di ALE staccato dalla superficie di Ca 2+ perline -ALE (minuscolo fiocco marrone nella figura 3e e 3f), quando il Ca 2+ -ALE perline erano stati immersi in formaldeide + NaOH e formammide + NaOH per tre ore rispettivamente. Questa somiglianza in termini di stabilità tra Ca 2+ perline -ALE e granuli aerobici indica che ALE sono una parte degli importanti polimeri strutturali che formano la matrice di gel AGS. Figura 3. granuli aerobici e ALE estratto. (A) granuli di pr acqua demineralizzataEstrazione ior. (B) ALE acido (estratto secondo i paragrafi 1.6 e 2) dopo centrifugazione a 4.000 xg e 4 ° C per 20 min. Risultati del test di stabilità dell'idrogel ionica. (C) Ca 2+ -ALE-perline conservati in acqua demineralizzata per 4 ore a 4 ° C. (D) Ca 2+ -ALE-perline memorizzati nel 2% EDTA, per 3 ore a 4 ° C. (E) Ca 2+ -ALE-perline memorizzati nel formammide + NaOH per 4 ore a 4 ° C. (F) Ca 2+ -ALE-perline memorizzati nella formaldeide + NaOH per 4 ore a 4 ° C. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Osservazioni per la sezione protocollo
L'estrazione di EPS / ALE è descritto per un volume di 50 ml e 3 g di granuli. Questi valori sono da intendersi come linee guida. Estrazioni con concentrazioni più elevate di granuli possono diminuire la resa dei EPS estratti. Durante l'estrazione ALE la temperatura deve essere mantenuta costante a 80 ° C per 30 min. Il tempo necessario per la miscela per riscaldare (circa 5 min) è incluso nel protocollo. Inoltre, l'efficacia di estrazione viene migliorata utilizzando un ancoretta magnetica della stessa dimensione del diametro del fondo matraccio. Questo si tradurrà in buone proprietà di miscelazione e effetti di fresatura, promuovendo l'estrazione di EPS.

Più tardi, nella sezione del protocollo, TS e VS rendimenti di tutte le estrazioni (surnatante raccolti nei passaggi 1.1-1.6) sono determinati. Dialisi deve essere eseguita prima della TS e VS misura di diminuire possibili errori dovuti alla presenza di sostanze chimiche usate per estrazioni. UNMWCO di 3.500 Da consiglia di rimuovere queste sostanze chimiche, pur mantenendo le macromolecole EPS all'interno del sacchetto di dialisi. La sacca di dialisi dovrebbe avere un volume maggiore del volume dell'estratto. Ciò è necessario, in quanto il volume dell'estratto aumenta durante la dialisi (ad esempio, per l'estrazione EDTA fino a aumento di volume del 40%). Il grado di rimozione chimica mediante dialisi può essere determinata misurando il pH nel campione prima e dopo la dialisi. In alternativa, misure di conducibilità dell'acqua di dialisi mostrano l'estensione della rimozione di ioni.

Per ottenere ALE dall importo totale estratto i EPS (punti 1.6 e 2) la fase di dialisi è facoltativo. Tuttavia, la dialisi ha tre vantaggi: riduce la quantità di HCl necessaria per la precipitazione, migliora il trasferimento di massa di acido nell'estratto e diminuisce il contenuto di ceneri del ALE ottenuto. Per la precipitazione di ALE è consigliabile utilizzare un bicchiere di vetro con un volume molto maggiore della estrat. Na 2 CO 3 è normalmente overdose nell'estrazione. Il HCl aggiunto sarà dapprima reagire con Na 2 CO 3 rimasti nell'estratto, causando la formazione di biossido di carbonio e, se il campione non è stato dializzato prima, in schiuma. Durante l'aggiunta di HCl, l'estratto dovrebbe essere mescolato lentamente di ancoretta magnetica della stessa dimensione del fondo del bicchiere. Una barra di agitazione di queste dimensioni e lenta agitazione si tradurrà in una miscelazione uniforme senza rompere la struttura del precipitato. Se grumi gel acidi si formano nell'estratto, il bicchiere deve essere agitato un po 'a mano. La precipitazione viene condotta con una concentrazione di acido di 1 M di evitare un forte aumento del volume dell'estratto mentre ancora ottenere una distribuzione omogenea di acido nel campione. concentrazioni di acido più elevate possono comportare una diminuzione del pH regionale e ciuffi gel acidi formazione. Un pH inferiore a 2,0 diminuisce la quantità di ALE che può essere recuperato, probabilmente a causa di cambiamenti strutturalidei polimeri a pH inferiore. E 'quindi importante mantenere il pH finale a 2,20 ± 0,05.

limitazioni
Il metodo di estrazione ALE intende estrarre polimeri extracellulari strutturali delle EPS da AGS o biofilm in generale e non è inteso per estrarre tutti presenti EPS. Per estrarre tutti EPS, una combinazione di più di un metodo di estrazione è necessaria. Inoltre, come illustrato con l'aumento della resa VS EPS applicando un'estrazione doppie e quadruple, una singola estrazione sarà non estrarre tutti EPS strutturali. Estrazione ALE è un metodo di estrazione EPS dura, combinando costante miscelazione con condizioni di calore e alcaline. Per questo motivo è possibile che materiale intracellulare viene estratto insieme ai EPS. Anche se la lisi cellulare può essere causato da tecniche di estrazione fisica e chimica (sonicazione 31,32, 31,32 NaOH, EDTA 11,32, CER 32, 32 e di calore ad alta taglio tassi di missaggio 19), la presenza di materiale intracellulare in EPS recuperati deve ancora essere verificata. La proprietà ionico gelificante delle EPS estratte è l'obiettivo principale di questa ricerca, se l'EPS recuperato contiene materiale intracellulare non è stato analizzato. La ricerca futura si concentrerà sull'identificazione materiale intracellulare nelle EPS estratti.

Solubilizzante la matrice idrogel di AGS è cruciale per estrarre EPS strutturali
EPS forma una matrice idrogel densa e compatta in AGS. Sebbene EPS contiene varie classi di macromolecole organiche quali polisaccaridi, proteine, acidi nucleici, lipidi (fosfo), sostanze umiche e alcuni polimeri intercellulari 7,5,8, non tutti formare un gel. Solo quei polimeri gelificanti sono qui considerati come polimeri strutturali in EPS.

Lo scopo di EPS estrazioni è per solubilizzare dapprima EPS e quindi raccogliere i EPS solubilizzate. Se l'EPS strutturale (vale a dire, tha EPS formando un idrogel) è la porta di estrazione, la matrice di gel di AGS deve essere solubilizzati prima. Solo metodi che possono solubilizzare la matrice di gel sono in grado di estrarre EPS strutturali. In questa ricerca, più frequenti utilizzate EPS metodi di estrazione, come centrifugazione 10-15, sonicazione 10,14,15, EDTA 10 – 12,14,15, formaldeide + NaOH 10 – 15 e formammide + NaOH 13 non poteva isolare efficacemente l'strutturale EPS. Ciò è dovuto al fatto che la matrice idrogel dei granuli aerobici non è stato solubilizzato con questi metodi. Per questo motivo, prove di stabilità nella sezione 4 sono stati eseguiti solo con le condizioni attuali in EDTA, formammide + NaOH e formaldeide + estrazione di NaOH. Questi tre estrazioni non erano in grado di isolare EPS strutturali, ma ancora ottenere il massimo rendimento VS EPS oltre il Na 2 CO 3 estrazione. condizioni Of Na 2 CO 3 estrazione non è applicata a questo metodo di estrazione chiaramente solubilizzati matrice AGS. Quindi le condizioni applicate durante la prova di stabilità sono state considerate rappresentative.

Estrazione con resina a scambio cationico (CER), un altro metodo di estrazione EPS utilizzato di frequente, non è stato considerato per questo confronto, come gli studi precedenti sulla estrazione EPS con CER non danno i risultati migliori rispetto alle estrazioni chimici utilizzati qui.

EPS gelificanti nei AGS
EPS gelificanti sono considerati come i EPS strutturali nella matrice idrogel di AGS. Vale la pena notare che ci sono vari tipi di idrogel come gel ionici, gel di temperatura indotta e gel pH indotti. Questo studio si concentra solo su EPS che formano gel ionici. Per quanto riguarda la grande frazione di materiale gel strutturale estratto, questo è probabilmente i EPS strutturali dominanti. Ci sono certamente possibilità che altri tipi di EPSche formano diversi tipi di idrogel (per esempio, pH gel indotta 28) esiste nello stesso o altro tipo di granuli aerobici. Tuttavia, non importa che tipo di idrogel è rivolto, solubilizzanti la matrice EPS gel è il passo più importante per estrarre EPS gelificanti.

Attualmente, poca ricerca è stata fatta su EPS strutturali del fango granulare. L'estrazione ALE descritto in questo protocollo è in grado di estrarre EPS gelificanti da AGS e verrà utilizzato in studi futuri per caratterizzare EPS strutturali. Più ricerca deve essere fatto su AGS, EPS strutturali e non strutturali EPS per meglio comprendere il processo e la funzione di granulazione e EPS. In particolare i seguenti tre punti devono essere indagati: il motivo per cui i microrganismi producono una tale quantità di EPS, qual è l'esatta composizione di EPS e di come è la composizione di EPS, modificate in funzione dei cambiamenti ambientali. Rilevamento e analisi di tutti i composti coinvolti e la loro interactions aiuterà a comprendere biofilm e come usarli a nostro vantaggio.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was financially supported by the SIAM Gravitation Grant 024.002.002, the Netherlands Organization for Scientific Research and by the Dutch Technology Foundation (STW – Simon Stevin Meester 2013). The authors want to thank Mario Pronk for providing the granular sludge samples.

Materials

250 ml baffled flask Kimble 25630-250
1000 ml glass beaker VWR 213-1128
RCT basic, magnetic stirrer with thermometer IKA 3810000
sodium carbonate decahydrate Merck KGaA 1063911000
50 ml centrifugation tubes greiner bio-one 227261
Multifuge 1 S-R, centrifuge Heraeus/Thermo Scientific –
hydrochloric acid, 37 % Sigma-Aldrich 30721-1L-GL-D
250 ml glass beaker VWR 213-1124
calcium chloride dihydrate Merck KGaA 1023821000
1 ml Pasteur Pipette Copan 201C
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Felz, S., Al-Zuhairy, S., Aarstad, O. A., van Loosdrecht, M. C., Lin, Y. M. Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge. J. Vis. Exp. (115), e54534, doi:10.3791/54534 (2016).
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