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Environment

Die Extraktion von Strukturextrazellulären polymeren Substanzen aus Aerobic Granular Sludge

Published: September 26, 2016
doi:
10.3791/54534
, , , ,
1Department of Biotechnology,Delft University of Technology, 2Department of Biotechnology, Norwegian Biopolymer Laboratory (NOBIPOL),Norwegian University of Science and Technology

Summary

Das Protokoll sieht eine Methodik aerobe granulare Schlamm löslich zu machen, um Alginat-ähnliche extrazelluläre Polymere (ALE) zu extrahieren.

Abstract

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na2CO3) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca2+). From the six extraction methods used, only the Na2CO3 extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca2+. The Ca2+-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.

Introduction

In den letzten Jahren hat sich die aerobe körniger Schlamm (AGS) Verfahren ein beliebtes biologischen Abwasserbehandlungsverfahren werden, erfolgreich an mehreren Full-Scale Abwasserbehandlung angewandt Pflanzen 1. Im Gegensatz zu dem Prozess herkömmlichen Belebtschlamm, in den AGS verarbeiten die Mikroorganismen bilden Granulat anstelle von Flocken 2. Diese Körner haben eine bessere Absetzbarkeit der Lage sind, höhere organische Raumbelastungen aushalten und haben eine höhere Toleranz gegenüber Toxizität als Belebtschlammflocken 3.

Im Gegensatz zu Biofilmen wird AGS 4 spontan , ohne Beteiligung von jedem Trägermaterial gebildet. In AGS, wie in Biofilmen, produzieren Mikroorganismen eine erhebliche Menge an stark hydratisierte extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) 5 eine Hydrogelmatrix zu bilden , in dem sie selbst immobilisiert sind 4 – 6. EPS sind eine komplexe Mischung von Polysacchariden, Proteinen, Nukleinsäuren besteht, (phospho) Lipiden, Huminstoffe und einige 5,7,8 interzellularen Polymere. Diese polymeren Substanzen interagieren miteinander durch elektrostatische Kräfte, Wasserstoffbrücken, ionische attraktive Kräfte und / oder biochemischer Reaktionen, etc. 5, eine dichte und kompakte Tertiärnetzwerkstruktur zu bilden. Die Polymere in der Lage sind , die EPS Hydrogele 4,9 zu bilden und zur Bildung des tertiären Netzstruktur sind in diesem Zusammenhang betrachtet als Struktur EPS, eine Teilmenge der Gesamt EPS beitragen.

EPS sind für die chemische Struktur und die physikalischen Eigenschaften der Körnchen 5 verantwortlich. Es ist daher entscheidend, um die Funktion der einzelnen EPS Verbindung zu verstehen. Es sind verschiedene Ansätze angewendet zu extrahieren EPS von 10 bis 15. Aufgrund ihrer extremen Komplexität ist es fast unmöglich, alle Komponenten des EPS durch eine einzige Methode zu extrahieren. Bis heute gibt es keine "one size fits all" Verfahren für EPS-Extraktion. Die Wahl des Extraktionsmethode beeinflusst nicht nur die Gesamtmenge, sondern auch die Zusammensetzung der zurückgewonnenen Polymere 13,16 – 20. Je nach Art des Schlammes und die EPS von Interesse verschiedene Methoden erforderlich sind.

Extrahieren gelbildende Polymere, ihre Eigenschaften Charakterisierung und Untersuchung von deren Wechselwirkungen untereinander und mit nicht-gelbildenden EPS wird helfen, die Rolle von EPS in aerobe körnige Schlammbildung zu offenbaren. Darüber hinaus sind die gelbildende Polymere auch nützlich Biopolymeren in industriellen Anwendungen. Eine mögliche Anwendung wurde bereits unter Verwendung von gelbildenden Polymeren aus AGS als Beschichtungsmaterial 21 gezeigt , die Wasserfestigkeit von Papier zu erhöhen.

Daher Extraktionsverfahren, die spezifisch für gelbildende EPS benötigt. Das Ziel dieser Studie ist es, eine Methodik zu entwickeln, gelbildende EPS von AGS zu extrahieren. Sechs Extraktionsverfahren 10-15,22, die in der Literatur häufig verwendet werden, wurden EPS von AGS zu extrahieren ausgewählt. Die Gesamtmenge und die gelbildende Eigenschaft der extrahierten EPS wurden für jede Methode verglichen.

Protocol

HINWEIS: AGS wurde aus dem Nereda Pilotreaktor in der Kläranlage Utrecht, Niederlande gesammelt. Der Reaktor wurde mit kommunalem Abwasser zugeführt. Das körnige Schlamm hatte einen Schlammvolumenindex (SVI 5min) von 59,5 ml / g VSS. Der Schlamm wurde im April am Ende eines aeroben Zyklus abgetastet. Nach der Probenentnahme wurde der Schlamm sofort in das Labor transportiert, gesiebt und bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert. 1. EPS-Extraktion HINWEIS: Centrifuge granulare Schlemme bei 4.000 × g und 4 ° C für 20 Minuten und dekantiert den Überstand. Sammeln Granulat im Pellet für den Extraktionen. Die Gesamtfeststoffe (TS) und flüchtige Feststoffe (VS) der Granulate wurden nach den Standardverfahren 23 bestimmt. Der Umrechnungsfaktor zwischen Granulat Naßgewicht – das Gewicht der direkt aus dem Pellet entnommen granules – und die TS wurde vor der Extraktion bestimmt. Alle Extraktionen wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt. HINWEIS: 3 g nass granules wurden für jede Extraktionsverfahren verwendet. Ihre TS und VS-Werte (0,39 g TS und 0,34 g VS), gemessen in dreifacher Ausführung wurden verwendet, um die Extraktionsausbeute zu berechnen. Zentrifugierung Extraktion 11 Übertragung 3 g (Nassgewicht) von Granulat in ein Zentrifugenröhrchen und füllen Sie das Zentrifugenröhrchen auf 50 ml mit demineralisiertem Wasser. Leicht schütteln Sie das Zentrifugationsröhrchen von Hand. Zentrifuge das Zentrifugationsröhrchen die Mischung bei 4.000 × g und 4 ° C für 20 min enthält. Sammeln Sie den Überstand in ein Becherglas, verwerfen das Pellet und weiterhin mit dem Überstand, wie in Abschnitt 1.7 beschrieben. Ultraschall – Behandlung Extraktion 10 Übertragung 3 g (Nassgewicht) von Granulat in ein Zentrifugenröhrchen und füllen Sie das Zentrifugenröhrchen auf 50 ml mit demineralisiertem Wasser. Anwenden gepulste Beschallung auf Eis für 2,5 min bei 40 W auf die Mischung. Zentrifugieren Sie die ZentrifugationRohr die Mischung bei 4.000 × g und 4 ° C für 20 min enthält. Sammeln Sie den Überstand in ein Becherglas, verwerfen das Pellet und weiterhin mit dem Überstand, wie in Abschnitt 1.7 beschrieben. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Extraktion 11 Übertragung 3 g (Nassgewicht) von Granulat in einer 100 ml Glasflasche und füllen Sie die Flasche zu 50 ml mit 2% (w / v) EDTA-Lösung. Leicht schütteln Sie die Flasche mit der Hand und speichern Sie sie im Kühlschrank bei 4 ° C für 3 Stunden. Übertragen der Mischung in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge das Zentrifugationsröhrchen die Mischung bei 4.000 × g und 4 ° C für 20 min enthält. Sammeln Sie den Überstand in ein Becherglas, verwerfen das Pellet und weiterhin mit dem Überstand, wie in Abschnitt 1.7 beschrieben. Formamid – Natriumhydroxid – Extraktion (NaOH) 13 Übertragung 3 g (Nassgewicht) von Granulat in einen 100ml-Glasflasche und die Flasche zu 50 ml mit demineralisiertem Wasser auffüllen. In 0,3 ml 99% Formamid. Leicht schütteln Sie die Flasche mit der Hand und speichern Sie sie im Kühlschrank bei 4 ° C für 1 Stunde. 20 ml 1 M NaOH zu der Granulatsuspension. Leicht schütteln Sie die Flasche mit der Hand und speichern Sie sie im Kühlschrank bei 4 ° C für 3 Stunden. Übertragen Sie die Mischung gleichmäßig in zwei 50 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge die Zentrifugationsröhrchen die Mischung bei 4.000 × g und 4 ° C für 20 min enthält. Sammeln Sie den Überstand in ein Becherglas, verwerfen das Pellet und weiterhin mit dem Überstand, wie in Abschnitt 1.7 beschrieben. Formaldehyd – NaOH – Extraktion 11 Übertragung 3 g (Nassgewicht) von Granulat in einer 100 ml Glasflasche und füllen Sie die Flasche zu 50 ml mit demineralisiertem Wasser. In 0,3 ml 37% Formaldehyd. Leicht schütteln Sie die Flasche mit der Hand und speichernim Kühlschrank bei 4 ° C für 1 Stunde. 20 ml 1 M NaOH zu der Granulatsuspension. Leicht schütteln Sie die Flasche mit der Hand und speichern Sie sie im Kühlschrank bei 4 ° C für 3 Stunden. Übertragen Sie die Mischung gleichmäßig in zwei 50 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge die Zentrifugationsröhrchen die Mischung bei 4.000 × g und 4 ° C für 20 min enthält. Sammeln Sie den Überstand in ein Becherglas, verwerfen das Pellet und weiterhin mit dem Überstand, wie in Abschnitt 1.7 beschrieben. Hochtemperatur – Natriumcarbonat Extraktion (Na 2 CO 3) 9,22,24 Vorheizen 150 ml Wasser in einem 1000 ml Becherglas auf einem Magnetrührer auf 80 ° C tippen. Übertragung 3 g (Nassgewicht) von Granulat in einem 250 ml Schikanekolben und füllen den Kolben auf 50 ml mit demineralisiertem Wasser. Zugabe von 0,25 g Na 2 CO 3 oder 0,67 g wasserfreies Na 2 CO 3 • 10H <sub> 2 O in den Kolben um eine 0,5% (w / v) Na 2 CO 3 -Konzentration zu erhalten. Setzen Sie den Kolben, der das Gemisch in das Wasserbad enthält. Decken Sie den Kolben und das Becherglas getrennt mit Aluminiumfolie Verdunstung verhindern. Rühren Sie die Mischung für 35 min bei 400 rpm und 80 ° C. Übertragen der Mischung in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge das Zentrifugationsröhrchen die Mischung bei 4.000 × g und 4 ° C für 20 min enthält. Sammeln Sie den Überstand und das Pellet verwerfen. TS und VS Messung aller Extrakte gemäß den Standardverfahren 23. Nehmen Sie den Überstand und dialysiere es für 24 Stunden gegen 1000 ml Reinstwasser (Dialysebeutel mit 3500 Da Molekulargewicht abgeschnitten (MWCO)) 11,12. Ändern des Dialysewasser nach 12 Stunden die Wirkung der Dialyse zu verbessern. Übertragen einer angemessenen Anteil (etwa 1/3) des dialysierten Überstandeine Aluminiumschale für TS und VS – Messung 23. HINWEIS: Trocknen Sie die Probe über Nacht bei 105 ° C. Die Gewichtsdifferenz des leeren Aluminiumschale und der Aluminiumschale die getrocknete Probe enthält, ist der TS-Gehalt. Dann brennen die gleiche Aluminiumschale die Probe bei 550 ° C für 2 Stunden enthält. Die Gewichtsdifferenz zwischen dem leeren Aluminiumschale und der Aluminiumschale die verbrannte Probe enthält, ist der Aschegehalt. Der Unterschied zwischen TS und Aschegehalt ist der VS-Gehalt. Für jeden Extrakt, übertragen Sie die restliche Fraktion des dialysierten Überstand auf 10 ml Glasbecher. Verdicken den Überstand für 2 Tage bei 60 ° C auf ein Endvolumen von 1-2 ml der Polymerkonzentration im Überstand zu erhöhen. 2. Alginate artigen extrazellulären polymeren (ALE) Extraktion Dialysieren des in Schritt erhaltenen Extrakts 1.6.8 gemäß Schritt 1.7.1. Übertragen Sie die dialysierte Extrakt in einen 250 ml Glasbecher. Langsamly rühren, die Extraktion bei 100 Umdrehungen pro Minute und Raumtemperatur. Ständig pH-Änderungen mit einer pH-Elektrode überwacht, während auf einen endgültigen pH von 2,2 ± 0,05 Zugabe von 1 M Salzsäure (HCl) ALE in der sauren Form zu erhalten. den pH-Wert auf 2,2, übertragen den Extrakt in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere bei 4.000 × g und 4 ° C für 20 min nach dem Einstellen. Überstand verwerfen und sammeln das gelartige Pellet. Die gelartige Pellet ALE in der sauren Form. Um die Natrium (oder Kalium) Form ALE erhalten, fügen langsam 0,5 M NaOH (0,5 M oder Kaliumhydroxid) zu dem Gel in Schritt erhaltenen 2,4, während das Gel langsam mit einem Glasstab von Hand Mischen, bis pH 8,5 erreicht ist. 3. Ionic Hydrogelierung-Test HINWEIS: Um zu überprüfen , ob die extrahierten EPS ionische Hydrogelbildungsschritt Eigenschaften hatte, eine Perlenbildungstest mit Ca 2+ -Ionen wurde 25 verwendet. Nach der Eindickung des Extrakts in Schritt 1.7.3 aufein Volumen von 1-2 ml, langsam das Gemisch mit einem Glasstab rühren und deren pH mit 0,5 M NaOH auf 8,5 einstellen. Nehmen den Extrakt aus Schritt 3.1 oder dem Natrium ALE aus Schritt 2.5 und tropft langsam des Extrakts mit einer Pasteur – Pipette in eine 2,5% (w / v) Calciumchlorid (CaCl 2) -Lösung. HINWEIS: Wenn das extrahierte EPS ionische Hydrogel gelbildende Eigenschaften aufweist, tropfenförmig (sphärisch) Perlen gebildet werden. Wenn der extrahierte EPS keine ionische Hydrogel gelbildende Eigenschaften aufweist, wird der Extrakt in der Lösung CaCl 2 dispergieren. 4. Stabilitätstest der ionischen Hydrogels ANMERKUNG: Um die Rolle des ionischen EPS Hydrogels in AGS Strukturbildung verstehen, Stabilitätstests wurden an den ionischen Hydrogelperlen des CO 2 Na 3 Extraktion durchgeführt, 3.2 in Schritt gesammelt. Halten Sie die Hydrogel – Kügelchen für 30 Minuten in der CaCl 2 -Lösung. Mit einem Löffel die Hydrogel – Kügelchen zu nehmen aus dem CaCl 2 </sub> Lösung und teilen Sie die Perlen in vier gleichen Anteilen. Store Fraktion 1 in 10 ml Wasser 4 Stunden lang bei 4ºC demineralisiert. Die folgenden Stabilitätstests wurden in der gleichen Weise durchgeführt, wie in den Extraktionsverfahren beschrieben 1,3-1,5. Store Fraktion 2 in 10 ml 2% (w / v) EDTA-Lösung für 3 Stunden bei 4 ° C. Store Fraktion 3 in 7,15 ml Wasser mit 60 & mgr; l 99% Formamid für 1 h bei 4ºC demineralisiert. Dann fügen Sie 2,85 ml 1 M NaOH und speichern Fraktion 3 für 3 Stunden bei 4 ° C. Store Fraktion 4 in 7,15 ml Wasser mit 60 & mgr; l 37% Formaldehyd für 1 h bei 4ºC demineralisiert. Dann fügen Sie 2,85 ml 1 M NaOH und speichern Fraktion 4 für 3 Stunden bei 4 ° C. Überwachen wenn sichtbare Zerfall der Kügelchen während der Lagerung unter den beschriebenen Bedingungen in 4,3-4,6 zu bewerten, wenn die Kügelchen die Extraktionsbedingungen standhalten.

Representative Results

EPS – Extraktion Das Auftreten von Granulaten nach verschiedenen EPS Extraktionsverfahren Anwendung ist in 1 gezeigt. Die Form und die Gelstruktur von Granulaten waren intakt nach dem Zentrifugieren (1a) und EDTA – Extraktion (Figur 1c). Granulat wurde in Fragmente unterschiedlicher Größen durch Beschallung aufgebrochen. Die Trübung in der flüssigen Phase könnte durch Suspension von kleinen Fragmenten (Abbildung 1b) , da die Trübung hoch nach Zentrifugation verringert. Formamid und Formaldehyd allein keine Auswirkungen hat auf die Form des Körnchens verändern und ihre Gelstruktur (Daten nicht gezeigt). Nach der Zugabe von NaOH, wandte sich die flüssige Phase gelblich. Einige flauschigen Material wurde von der Oberfläche des Granulats gelöst und bildete eine Schicht auf der Oberseite der abgesetzten Granulate (Figur 1d und 1e). Trotzdem ist die Form desGranulat wurde nicht verändert. Die Zugabe von NaOH verbessert anscheinend EPS Solubilisierung, konnte aber die Gelmatrix-Struktur nicht beschädigen. Im Vergleich dazu Granulat nach Na 2 CO 3 Extraktion (1f) vollständig verschwunden. Stattdessen wird eine Mischung aus nach dem Sol-ähnliche Flüssigkeit und kleine gallertartige Teilchen gebildet wurden, wurde die Gelmatrix von Granulaten zeigt tatsächlich solubilisiert. Abbildung 1. Aerobic körniger Schlamm EPS – Extraktionen. Zur besseren Visualisierung der Auswirkungen der einzelnen Extraktionsverfahren auf das Granulat, Experimente wurden in 25 ml Glasflaschen durchgeführt. Nach dem Extraktionsverfahren, die Extrakte wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur gehalten, damit Schwebstoffe absetzen. (A) Zentrifugieren Extraktion, (b) Beschallen Extraktion, (c) EDTA – Extraktion, (d) Formamid – NaOH Extraction, (e) Formaldehyd – NaOH – Extraktion, (f) Hochtemperatur -. Na 2 CO 3 Extraktion Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. EPS – Ausbeute für jede Methode zur VS – Fraktion mit Bezug ist in Figur 2 veranschaulicht. Die Ausbeute ist in mg pro g VS EPS anfänglichen VS Granulat vorgelegt. Die Menge an EPS von Formaldehyd + NaOH, Formamid + NaOH und Na 2 CO 3 + Heizen + war höher als die der Zentrifugation, Ultrabeschallung und EDTA – Extraktion gemischt wird . 13,15 darauf hinweist , dass alkalischen Bedingungen EPS Löslichkeit 26,27 verbessern – Ähnliche Ergebnisse für diese Extraktionstechniken wurden auch von früheren Studien 11 gezeigt. Die Menge an EPS gewonnen durch Na 2 CO 3 die höchste war, mehr als 20-fache der nur durch Zentrifugation erhalten. Zusätzlich kann die Gesamtausbeute des EPS Na 2 CO 3 Extraktion weiter durch mehrere Extraktionen verbessert werden. Eine zweite Extraktion das Pellet verworfen in Schritt 1.6.8 (Protokollabschnitt) der ersten Extraktion erhöht die Gesamtausbeute von 28%, eine vierfache Extraktion erhöht auch die Gesamtausbeute von 46% verwendet wird. Abbildung 2. Ergebnisse aller Extraktionsmethoden in Bezug auf VS – Ausbeute und Aschegehalt. Für jede Extraktion der erste Takt des VS – Ausbeute in mg stellt VS EPS pro g Anfangs VS Granulat. Der zweite Balken stellt den Gewichtsprozentsatz der Asche in den extrahierten TS. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung der drei Extraktionen für jede Extraktionstechnik durchgeführt."_blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Alginate artigen extrazellulären Polymer (ALE) Extraktion Nachdem der pH – Wert der durch die Na 2 CO 3 Extraktion extrahiert EPS auf 2,2 eingestellt war, wurde 63% des gesamten VS ausgefällt. Der Niederschlag ist sauer ALE 25. Die Restfraktion war wahrscheinlich EPS, die unter den Extraktionsbedingungen löslich gemacht werden kann, aber keinen Niederschlag bei pH 2,2 bilden. Ionic Hydrogelbildungsschritt Test Aerobic Granula wurden als ähnlich zu einem Hydrogel beschrieben. Das Granulierungsverfahren wurde als gelbildende Phänomen mit Glycosiden als Geliermittel 4,9,25,28 angesehen worden. Normalerweise Ca 2+ ist eines der am häufigsten verwendeten Kationen im Abwasser. Außerdem bindet es leicht mit sauren Polysacchariden (zBAlginate und Poly-Galacturonsäure), vermutlich als Gegenion zu vermitteln Gelierung 29. resultierende somit in einem ionisch vernetzten Hydrogels. Es wurde beobachtet , daß die Zugabe von Ca 2+ -Ionen aerobe Schlamm Granulation 30 beschleunigen kann. Daher Ca 2+ -EPS (ionische Hydrogel) könnte eine wichtige Rolle spielen , um die Gel – Matrix – Struktur in aeroben körniger Schlamm in den Aufbau. In diesem Zusammenhang , ob die extrahierten EPS bildet ein ionisches Hydrogel mit Ca 2+ -Ionen als Test verwendet werden könnte , um zu überprüfen , ob die extrahierte EPS zur Bildung einer strukturellen Polymer des Gels beitragen Matrix in aerobe körnige Schlämme 9. In dieser Forschung für die EPS aus AGS (Abbildung 3a) durch verschiedene Verfahren extrahiert werden , nur die von Na 2 CO 3 extrahiert EPS gehalten , die Form eines Tropfens in 2,5% (w / v) CaCl & sub2 ; -Lösung und bildeten stabile ionische Hydrogelperlen .Außerdem EPS das Natrium ALE daraus erhalten durch zusätzliche Schritte (ALE Polymer – Extraktion, 3b) angezeigt und die gleiche Eigenschaft. Die Farbe und die Morphologie der Ca 2+ -ALE Gelkügelchen (Abbildung 3c) sind ähnlich aeroben granulare Schlamm (Abbildung 3a). Offenbar ist die durch die Na 2 CO 3 Verfahren extrahiert EPS trägt zur Bildung der Gelmatrix in aerobe körnige Schlämme. ALE, das eine Hauptkomponente dieses EPS ist es strukturelle Polymere können ein ionisches Hydrogel zu bilden. Stabilitätstest des ionischen Hydrogel Es wurde während der EPS – Extraktion, aerobe Granulat behielten ihre sphärische Form in EDTA, Formaldehyd und Formamid + NaOH + NaOH (1) festgestellt , daß. Um herauszufinden, ob die extrahierten Strukturpolymere zu verstehen , eine Rolle bei der Stabilität der Granulate, Ca 2+ -ALE Perlen spielen warengenau die gleiche Weise wie aerobe Granulat bei der Extraktion behandelt. Interessanterweise angezeigt Ca 2+ -ALE beads die ähnliche Stabilitäten wie der AGS (Abbildung 3d – 3f), dh Ca 2+ -ALE beads in EDTA äußerst stabil waren. Es gab wenig Menge an ALE von der Oberfläche des Ca 2+ freistehend -ALE Perlen (winzige bräunlich Flocke in Abbildung 3e und 3f), wenn die Ca 2+ -ALE Perlen waren in Formaldehyd + NaOH und Formamid + NaOH drei Stunden lang getränkt , beziehungsweise. Diese Ähnlichkeit in Bezug auf die Stabilität zwischen Ca 2+ -ALE Perlen und aerobe Granulat zeigt an, dass ALE ein Teil der wichtigen strukturellen Polymere bilden die AGS Gel – Matrix sind. Abbildung 3. Aerobic – Granulat und extrahiert ALE. (A) Ein Granulat in demineralisiertem Wasser prIOR-Extraktion. (B) Saure ALE (extrahiert gemäß den Absätzen 1.6 und 2) nach der Zentrifugation bei 4.000 × g und 4 ° C für 20 min. Ergebnisse der Stabilitätstests der ionischen Hydrogel. (C) Ca 2+ -ALE Perlen in demineralisiertes Wasser für 4 Stunden bei 4 ° C gelagert. (D) Ca 2+ -ALE-beads für 3 h bei 4 ° C in 2% EDTA, gespeichert. (E) Ca 2+ -ALE-beads in Formamid gespeichert + NaOH 4 h bei 4 ° C. (F) Ca 2+ gespeichert -ALE-Perlen in Formaldehyd + NaOH 4 h bei 4 ° C. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Hinweise für den Protokollabschnitt
Die Extraktion von EPS / ALE wird mit einem Volumen von 50 ml und 3 g Granulat beschrieben. Diese Werte werden als Richtlinien beabsichtigt. Extraktionen mit höherer Granulat Konzentrationen können die Ausbeute der extrahierten EPS verringern. Bei der Gewinnung von ALE sollte die Temperatur für 30 min bei 80 ° C konstant gehalten werden. Die Zeit für die Mischung erforderliche aufzuheizen (ca. 5 min) wird in dem Protokoll enthalten. Weiterhin wird die Extraktionseffizienz durch die Verwendung eines magnetischen Rührstabs der gleichen Größe wie der Durchmesser des Kolbens unten erweitert. Dies wird in einem guten Mischeigenschaften und Fräsen Wirkungen führen, die Extraktion von EPS zu fördern.

Später im Protokollabschnitt, TS und VS Erträge aller Extraktionen (Überstand gesammelt in Schritten von 1,1 bis 1,6) bestimmt. Dialyse muss vor TS und VS-Messung durchgeführt werden, um mögliche Fehler der Anwesenheit von Chemikalien für Extraktionen verwendet aufgrund verringern. EINMWCO von 3500 Da wird empfohlen, diese Chemikalien zu entfernen, während die EPS-Makromoleküle innerhalb der Dialysebeutel zu halten. Die Tasche Dialyse sollte ein größeres Volumen als das Volumen des Extrakts haben. Dies ist notwendig, weil das Volumen des Extraktes während der Dialyse (zB für EDTA – Extraktion bis zu 40% Volumenerhöhung) zu erhöhen. Das Ausmaß der chemischen Entfernung durch Dialyse kann durch Messung des pH-Wertes in der Probe vor und nach der Dialyse bestimmt. Alternativ zeigen Leitfähigkeitsmessungen des Dialysewasser, das Ausmaß der Ionenentfernung.

Um ALE aus der Summe der extrahierten EPS (Schritte 1,6 und 2) die Dialyseschritt ist optional erhalten. Dennoch hat Dialyse drei Vorteile: es reduziert die Menge an HCl zur Fällung erforderlich ist, den Säuremassentransfer im Extrakt erhöht, und verringert den Aschegehalt des erhaltenen ALE. Für die Fällung von ALE wird empfohlen, ein Becherglas mit einem wesentlich größeren Volumen als das extrac verwendent. Na 2 CO 3 ist normalerweise in der Extraktionsüberdosiert. Die hinzugefügte HCl wird zuerst mit dem Na 2 CO 3 reagieren gelassen in dem Extrakt, was zu einer Bildung von Kohlendioxid und, falls die Probe nicht vor dialysiert wurde, in Schäumen. Während der Zugabe von HCl, sollte der Extrakt langsam mit einem magnetischen Rührstab mit der gleichen Größe wie der Boden des Becherglases gerührt werden. Ein Rührstab dieser Größe und langsamem Rühren wird, ohne die Struktur des Niederschlags in noch Mischen zur Folge haben. Wenn saure Gelklumpen in dem Extrakt gebildet werden, sollte das Becherglas von Hand leicht aufgewirbelt werden. Die Fällung wird mit einer Säure-Konzentration von 1 M führten eine große Volumenerhöhung des Extrakts zu vermeiden, während immer noch eine homogene Verteilung der Säure in der Probe zu erhalten. Höhere Säurekonzentrationen können in einem regionalen pH-Abnahme und sauren Gelklumpen Bildung führen. Ein pH-Wert niedriger als 2,0 verringert die Menge der ALE die wiederhergestellt werden können, wahrscheinlich aufgrund der strukturellen Veränderungender Polymere bei niedrigeren pH-Wert. Es ist daher wichtig bei 2,20 ± 0,05 Der End-pH zu halten.

Einschränkungen
Das ALE-Extraktions-Verfahren zielt darauf ab, strukturelle extrazelluläre Polymere des EPS von AGS oder Biofilmen im Allgemeinen zu extrahieren und nicht alle aktuellen EPS zu extrahieren soll. Um alle EPS extrahieren, eine Kombination von mehr als einem Extraktionsverfahren erforderlich. Außerdem ist , wie mit der Zunahme des VS EPS Ausbeute gezeigt durch eine doppelte und vierfache Extraktion Anwendung einer einzigen Extraktion nicht alle strukturellen EPS extrahieren. ALE-Extraktion ist eine harte EPS-Extraktionsverfahren, ständige Durchmischung mit Wärme und alkalischen Bedingungen zu kombinieren. Aus diesem Grund ist es möglich, dass einige intrazellulärem Material zusammen mit den EPS extrahiert wird. Obwohl Zelllyse kann durch physikalische und chemische Extraktionstechniken (Beschallung 31,32, 31,32 NaOH, EDTA 11,32, CER 32, 32 Wärme und hohen Scherraten von m verursacht werdenixing 19), muss das Vorhandensein von intrazellulärem Material in zurückgewonnen EPS noch verifiziert werden. Die ionische gelbildende Eigenschaft der extrahierten EPS ist der Schwerpunkt dieser Forschung, ob das wiedergewonnene EPS intrazelluläre Material enthält, wurde nicht untersucht. Zukünftige Forschung wird auf die Identifizierung intrazellulären Material in den extrahierten EPS konzentrieren.

Die Hydrogelmatrix von AGS Löslichmachende ist entscheidend strukturelle EPS zu extrahieren
EPS bildet eine dichte und kompakte Hydrogelmatrix in AGS. Obwohl EPS verschiedenen Klassen von organischen Makromolekülen wie Polysacchariden, Proteinen, Nukleinsäuren enthält, (phospho) Lipiden, Huminstoffe und einige interzellularen Polymere 7,5,8, nicht alle von ihnen ein Gel bilden. Es werden nur die gelbildende Polymere hier als Strukturpolymere in EPS betrachtet.

Das Ziel der EPS-Extraktionen ist zum ersten EPS löslich zu machen und dann die solubilisierten EPS zu sammeln. Wenn die Struktur EPS (dh ter EPS ein Hydrogel bildet) ist das Ziel der Extraktion, die Gelmatrix von AGS muss zuerst solubilisiert werden. Nur Methoden, die die Gel-Matrix sind in der Lage zu extrahieren Struktur EPS solubilisieren können. In dieser Forschung verwendet , um einige häufig EPS – Extraktionsverfahren, wie Zentrifugation , 10 – 15 Beschallungs 10,14,15, 10 EDTA – 12,14,15, Formaldehyd + NaOH 10 – 15 und Formamid + NaOH 13 nicht effizient die strukturelle isolieren könnte EPS. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass die Hydrogelmatrix der aeroben Granulate mit diesen Verfahren nicht solubilisiert wurde. Aus diesem Grund Stabilitätstests in Abschnitt 4 wurden nur mit Bedingungen in EDTA, Formamid + NaOH und Formaldehyd + NaOH Extraktion durchgeführt. Diese drei Extraktionen waren nicht in der Lage zu isolieren Struktur EPS ; , aber immer noch die höchste VS EPS Ausbeute neben der Na 2 CO 3 Extraktion. Bedingungen of die Na 2 CO 3 Extraktion wurden nicht als dieses Extraktionsverfahren deutlich solubilisiert die AGS Matrix aufgebracht. Daher sind die angewandten Bedingungen während der Stabilitätstest wurden als repräsentativ angesehen.

Die Extraktion mit Kationenaustauschharz (CER), einem anderen häufig verwendeten EPS-Extraktionsverfahren wurde nicht für diesen Vergleich betrachtet, da frühere Studien auf EPS-Extraktion mit CER hier nicht bessere Ergebnisse als die chemischen Extraktionen brachte.

Gelbildenden EPS in AGS
Gelbildenden EPS werden als die Struktur EPS in der Hydrogelmatrix von AGS betrachtet. Es ist erwähnenswert, dass es verschiedene Arten von Hydrogelen, wie ionische Gele, temperaturbedingte Gele und pH-induzierte Gele sind. Diese Studie konzentriert sich nur auf EPS, die ionische Gele bilden. die große Anteil an Struktur Gel-Material extrahiert In Bezug auf, ist dies wahrscheinlich die dominanten strukturellen EPS zu sein. Es gibt sicherlich Möglichkeiten, die andere Arten von EPSdiese Form verschiedene Arten von Hydrogele (beispielsweise pH induzierte gel 28) gibt es in der gleichen oder einer anderen Art von aeroben Granulate. Dennoch, egal welche Art von Hydrogel wird gezielt, Lösungs die EPS-Gel-Matrix ist der wichtigste Schritt ist gelbildenden EPS zu extrahieren.

Derzeit hat wenig Forschung über strukturelle EPS von körnigem Schlamm geschehen. Das ALE-Extraktion in diesem Protokoll beschrieben ist in der Lage gelbildenden EPS aus AGS Extrahieren und wird in weiteren Studien verwendet werden, um strukturelle EPS zu charakterisieren. Mehr Forschung muss auf AGS, strukturelle EPS und nicht-strukturellen EPS getan werden, um den Prozess besser und Funktion der Granulation und EPS verstehen. Vor allem müssen die folgenden drei Punkte untersucht werden: warum Mikroorganismen, eine große Menge an EPS produzieren, was ist die genaue Zusammensetzung von EPS und wie wird die Zusammensetzung der EPS auf Umweltveränderungen modifiziert abhängig. Das Erkennen und die Analyse aller beteiligten Verbindungen und ihre interactions helfen Biofilmen und wie nutzen sie zu unserem Vorteil zu verstehen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was financially supported by the SIAM Gravitation Grant 024.002.002, the Netherlands Organization for Scientific Research and by the Dutch Technology Foundation (STW – Simon Stevin Meester 2013). The authors want to thank Mario Pronk for providing the granular sludge samples.

Materials

250 ml baffled flask Kimble 25630-250
1000 ml glass beaker VWR 213-1128
RCT basic, magnetic stirrer with thermometer IKA 3810000
sodium carbonate decahydrate Merck KGaA 1063911000
50 ml centrifugation tubes greiner bio-one 227261
Multifuge 1 S-R, centrifuge Heraeus/Thermo Scientific –
hydrochloric acid, 37 % Sigma-Aldrich 30721-1L-GL-D
250 ml glass beaker VWR 213-1124
calcium chloride dihydrate Merck KGaA 1023821000
1 ml Pasteur Pipette Copan 201C
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References

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Felz, S., Al-Zuhairy, S., Aarstad, O. A., van Loosdrecht, M. C., Lin, Y. M. Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge. J. Vis. Exp. (115), e54534, doi:10.3791/54534 (2016).
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