Le protocole fournit une méthodologie pour solubiliser aérobie granulaire boues afin d'en extraire les polymères extracellulaires alginate-like (ALE).
To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na2CO3) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca2+). From the six extraction methods used, only the Na2CO3 extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca2+. The Ca2+-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.
Au cours des dernières années , la boue granulaire (AGS) processus aérobie est devenu un procédé de traitement biologique des eaux usées populaire, appliquée avec succès à plusieurs à grande échelle des usines de traitement des eaux usées 1. Contrairement au procédé classique de boues activées, dans le processus les AGS les microorganismes forment des granules au lieu de flocs 2. Ces granules ont une meilleure décantation, sont capables de résister à des taux plus élevés de charge organique, et ont une plus grande tolérance à la toxicité de flocs de boues activées 3.
Contrairement à biofilms, AGS est formé spontanément sans intervention d'un matériau de support 4. AGS, comme dans les films biologiques, les micro – organismes produisent une quantité importante de substances polymères extracellulaires fortement hydratés (EPS) 5 pour former une matrice d'hydrogel dans laquelle elles sont auto-immobilisé 4 – 6. EPS sont un mélange complexe comprenant des polysaccharides, des protéines, des acides nucléiques (phospho) des lipides, des substances humiques et certains polymères intercellulaires 5,7,8. Ces substances polymères interagissent les uns avec les autres par des forces électrostatiques, des liaisons hydrogène, forces ioniques attractifs et / ou des réactions biochimiques, etc. 5, formant une structure de réseau tertiaire dense et compact. Les polymères EPS qui sont capables de former des hydrogels 4,9 et contribuer à la formation de la structure du réseau tertiaire sont à cet égard considéré comme BPA structurel, un sous – ensemble du nombre total de BPA.
EPS sont responsables de la structure chimique et les propriétés physiques des granulés 5. Il est donc crucial de comprendre la fonction de chaque composé EPS. Diverses approches sont appliquées pour extraire EPS 10-15. Cependant, en raison de leur extrême complexité, il est presque impossible d'extraire tous les composants EPS par une seule méthode. À ce jour, il n'y a pas de «one size fits all" méthode pour l'extraction EPS. Le choix de la méthode d'extraction , non seulement influe sur le prix total, mais aussi la composition des polymères récupérés 13,16 – 20. Selon le type de boue et les EPS d'intérêts différentes méthodes sont nécessaires.
Extraction des polymères gélifiants, caractériser leurs propriétés et étudier leurs interactions les uns avec les autres et avec EPS non gélifiants aidera à révéler le rôle des EPS en aérobie formation granulaire des boues. En outre, les polymères formant des gels biopolymères sont aussi utiles dans des applications industrielles. Une application possible a déjà été démontré en utilisant des polymères formant un gel à partir d' AGS en tant que matériau de revêtement pour augmenter la résistance à l'eau du papier 21.
Par conséquent, des procédés d'extraction, spécifiques pour les BPA de formation de gel sont nécessaires. Le but de cette étude est de développer une méthodologie pour extraire EPS de formation de gel d'AGS. Six méthodes d'extraction 10 – 15,22, qui sont fréquemment utilisés dans la littérature, ont été sélectionnés pour extraire EPS de AGS. Le montant total et la propriété de formation de gel des EPS extraits ont été comparés pour chaque méthode.
Remarques pour la section de protocole
L'extraction de l'EPS / ALE est décrit pour un volume de 50 ml et 3 g de granulés. Ces valeurs sont des directives. Extractions avec des concentrations plus élevées de granules peuvent diminuer le rendement des EPS extraits. Lors de l'extraction d'ale la température doit être maintenue constante à 80 ° C pendant 30 min. Le temps nécessaire pour que le mélange se réchauffer (environ 5 min) est inclus dans le protocole. En outre, l'efficacité d'extraction est améliorée en utilisant une barre d'agitation magnétique de la même taille que le diamètre du fond du flacon. Cela se traduira par de bonnes propriétés de mélange et d'effets de fraisage, favorisant l'extraction de l'EPS.
Plus tard dans la section de protocole, et TS VS rendements de toutes les extractions (surnageant recueilli dans les étapes 1.1-1.6) sont déterminées. La dialyse doit être effectuée avant la TS et VS mesure de diminuer les éventuelles erreurs dues à la présence de produits chimiques utilisés pour les extractions. UNEMWCO de 3500 Da est recommandé de retirer ces produits chimiques, tout en conservant les macromolécules EPS dans le sac de dialyse. Le sac de dialyse doit avoir un volume plus grand que le volume de l'extrait. Cela est nécessaire, car le volume de l'extrait va augmenter au cours de la dialyse (par exemple, pour l' extraction de l' EDTA jusqu'à l' augmentation du volume de 40%). L'étendue de l'élimination chimique par dialyse peut être déterminée en mesurant le pH de l'échantillon avant et après la dialyse. En variante, des mesures de conductivité de l'eau de dialyse montrent l'étendue de l'élimination d'ions.
Pour obtenir ALE du total extrait EPS (étapes 1,6 et 2) l'étape de dialyse est facultative. Néanmoins, la dialyse a trois avantages: elle réduit la quantité d'acide chlorhydrique nécessaire à la précipitation, il améliore le transfert de masse de l'acide dans l'extrait et diminue la teneur en cendres de l'ALE obtenu. Pour la précipitation d'ALE, il est recommandé d'utiliser un récipient en verre d'un volume beaucoup plus grand que le extract. Na 2 CO 3 est normalement dans l'extraction surdosé. HCl ajoutée va d' abord réagir avec le Na 2 CO 3 , à gauche dans l'extrait, ce qui entraîne la formation de dioxyde de carbone et, si l'échantillon n'a pas été dialysée avant, dans la formation de mousse. Au cours de l'addition de HCl, l'extrait doit être agité lentement avec une barre d'agitation magnétique de la même taille que le fond du récipient. Une barre d'agitation de cette taille et une agitation lente se traduira par un mélange homogène sans casser la structure du précipité. Si des touffes de gel acides sont formés dans l'extrait, le récipient doit être tourbillonné légèrement à la main. La précipitation est réalisée avec une concentration d'acide de 1 M pour éviter une augmentation importante du volume de l'extrait tout en obtenant une répartition homogène de l'acide dans l'échantillon. Les concentrations d'acide plus élevées peuvent entraîner une diminution de la formation de la région de pH et des touffes de gel acide. Un pH inférieur à 2,0 diminue la quantité d'ALE qui peut être récupéré, sans doute en raison de changements structurelsdes polymères à un pH inférieur. Il est donc important de maintenir le pH final à 2,20 ± 0,05.
Limites
La méthode d'extraction ALE vise à extraire les polymères extracellulaires structurelles des EPS de AGS ou biofilms en général et ne vise pas à extraire tous les EPS présents. Pour extraire tous les EPS, une combinaison de plus d'un procédé d'extraction est nécessaire. En outre, comme le montre l'augmentation du rendement VS EPS en appliquant une extraction double et quadruple, une seule extraction ne sera pas extraire tous les EPS structurels. l'extraction d'ALE est un procédé d'extraction EPS dure, en combinant un mélange constant avec des conditions de chaleur et alcalino-terreux. Pour cette raison, il est possible que certains matériel intracellulaire est extrait conjointement avec l'EPS. Bien que la lyse cellulaire peut être causée par des techniques d'extraction physique et chimique (sonication 31,32, 31,32 NaOH, EDTA 11,32, CER 32, 32 et chaleur à cisaillement élevé des taux par mIXING 19), la présence de matière intracellulaire en EPS récupérées doit encore être vérifiée. La propriété ionique de formation de gel des EPS extraites est l'objectif principal de cette recherche, si l'EPS récupéré contient du matériel intracellulaire n'a pas été analysé. La recherche future se concentrera sur l'identification matériel intracellulaire dans les EPS extraits.
Solubiliser la matrice d'hydrogel de l' AGS est cruciale pour extraire EPS structurelles
formes EPS une matrice d'hydrogel dense et compact dans AGS. Bien que EPS contient différentes classes de macromolécules organiques tels que des polysaccharides, des protéines, des acides nucléiques (phospho) lipides, des substances humiques et des polymères intercellulaires 7,5,8, pas tous former un gel. Seuls les polymères gélifiants sont ici considérés comme des polymères de structure en EPS.
Le but de l'extraction EPS est d'abord solubiliser EPS, puis de recueillir les EPS solubilisées. Si les EPS structurelles (c. -à- til EPS formant un hydrogel) est la cible de l'extraction, la matrice de gel d'AGS doit être solubilisé en premier. Seules les méthodes qui peuvent solubiliser la matrice de gel sont capables d'extraire EPS structurelles. Dans cette recherche, certains utilisés fréquemment EPS procédés d'extraction tels que la centrifugation 10 – 15, 10,14,15 sonification, de l' EDTA 10 – 12,14,15, du formaldéhyde + NaOH 10 – 15 et + NaOH 13 formamide n'a pas pu isoler efficacement la structure EPS. Ceci est dû au fait que la matrice d'hydrogel des granulés aérobie n'a pas été solubilisée par ces méthodes. Pour cette raison, les tests de stabilité à l'article 4 ont été effectuées uniquement avec des conditions présentes dans l'EDTA, NaOH formamide + et le formaldéhyde + extraction NaOH. Ces trois extractions ne sont pas capables d'isoler EPS structurels, mais encore obtenu le rendement le plus élevé VS EPS outre le 2 CO 3 extraction Na. Conditions of le Na 2 CO 3 extraction n'a pas été appliquée car cette méthode d'extraction clairement solubiliser la matrice AGS. Par conséquent, les conditions appliquées au cours de l'essai de stabilité ont été considérés comme représentatifs.
Extraction avec de la résine d'échange de cations (CER), une autre méthode d'extraction EPS fréquemment utilisé, n'a pas été considéré pour cette comparaison, car les études antérieures sur l'extraction des EPS avec CER n'a donné de meilleurs résultats que les extractions chimiques utilisées ici.
EPS Gel filmogène dans AGS
EPS gélifiantes sont considérés comme l'EPS structurels dans la matrice d'hydrogel d'AGS. Il convient de souligner qu'il existe différents types d'hydrogels tels que des gels ioniques, gels induites par la température et les gels pH induits. Cette étude porte uniquement sur les EPS qui forment des gels ioniques. En ce qui concerne la grande fraction de matériau de gel de structure extraite, cela est susceptible d'être l'EPS structurelles dominantes. Il y a certainement des possibilités que d'autres types d'EPScette forme de différents types d'hydrogels (par exemple, pH gel induite 28) existe dans le même ou un autre type de granules aérobies. Néanmoins, peu importe quel type d'hydrogel est ciblé, solubilisation de la matrice de gel EPS est l'étape la plus importante pour extraire EPS de formation de gel.
Actuellement, peu de recherches ont été effectuées sur EPS structurelles de boue granulaire. L'extraction ALE décrit dans ce protocole est capable d'extraire l'EPS gélifiantes de l'AGS et seront utilisées dans des études ultérieures pour caractériser EPS structurelles. Plus de recherche doit être fait sur AGS, EPS structurelles et non structurelles EPS afin de mieux comprendre le processus et la fonction de la granulation et EPS. Surtout les trois points suivants doivent être étudiés: pourquoi les micro-organismes produisent une telle quantité d'EPS, quelle est la composition exacte des EPS et comment est la composition des EPS modifiée en fonction des changements environnementaux. La détection et l'analyse de tous les composés impliqués et leur interactions vous aidera à comprendre les biofilms et la façon de les utiliser à notre avantage.
The authors have nothing to disclose.
This research was financially supported by the SIAM Gravitation Grant 024.002.002, the Netherlands Organization for Scientific Research and by the Dutch Technology Foundation (STW – Simon Stevin Meester 2013). The authors want to thank Mario Pronk for providing the granular sludge samples.
250 ml baffled flask | Kimble | 25630-250 | |
1000 ml glass beaker | VWR | 213-1128 | |
RCT basic, magnetic stirrer with thermometer | IKA | 3810000 | |
sodium carbonate decahydrate | Merck KGaA | 1063911000 | |
50 ml centrifugation tubes | greiner bio-one | 227261 | |
Multifuge 1 S-R, centrifuge | Heraeus/Thermo Scientific | – | |
hydrochloric acid, 37 % | Sigma-Aldrich | 30721-1L-GL-D | |
250 ml glass beaker | VWR | 213-1124 | |
calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 1023821000 | |
1 ml Pasteur Pipette | Copan | 201C |