استخراج المواد الإنشائية خارج الخلية البوليمرية من هوائية حبيبي الحمأة
Summary
وينص البروتوكول منهجية لإذابة الهوائية الحمأة الحبيبية من أجل انتزاع البوليمرات خارج الخلية مثل الجينات (الرابطة).
Abstract
To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na2CO3) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca2+). From the six extraction methods used, only the Na2CO3 extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca2+. The Ca2+-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.
Introduction
في السنوات الأخيرة أصبحت عملية الهوائية الحمأة الحبيبية (قسم الخدمات الزراعية) والبيولوجية عملية معالجة مياه الصرف الصحي الشعبية، وطبقت بنجاح في عدة واسعة النطاق محطات معالجة مياه الصرف الصحي 1. وعلى النقيض من عملية الحمأة المنشطة التقليدية، في العملية قسم الخدمات الزراعية الكائنات الدقيقة تشكل حبيبات بدلا من flocs 2. هذه الحبيبات لها settleability أفضل، قادرة على تحمل ارتفاع معدلات التحميل العضوية، ويكون أعلى التسامح إلى سمية من flocs الحمأة المنشطة 3.
على عكس الأغشية الحيوية، ويتكون قسم الخدمات الزراعية من تلقاء أنفسهم دون تدخل من أي مواد الناقل 4. في قسم الخدمات الزراعية، مثل في الأغشية الحيوية، والكائنات الدقيقة وتنتج كمية كبيرة من المواد البوليمرية خارج الخلية رطب للغاية (EPS) 5 لتشكيل مصفوفة هيدروجيل التي يوجدون فيها 4-يجمد الذاتي – 6. EPS هي خليط معقد، وتتكون من السكريات والبروتينات والأحماض النووية، (phospهو) والدهون، والمواد الدبالية وبعض البوليمرات بين الخلايا 5،7،8. هذه المواد البوليمرية تتفاعل مع بعضها البعض من خلال قوات كهرباء والسندات الهيدروجين، قوات الأيونية جذابة و / أو التفاعلات الكيميائية الحيوية، الخ 5، وتشكيل هيكل الشبكة العالي الكثيفة والمدمجة. البوليمرات في EPS التي هي قادرة على تشكيل الهلاميات المائية 4،9 والمساهمة في تشكيل بنية الشبكة العالي هي في هذا الصدد تعتبر EPS الهيكلية، مجموعة فرعية من مجموع EPS.
EPS هي المسؤولة عن التركيب الكيميائي والخواص الفيزيائية للحبيبات 5. وبالتالي لا بد من فهم وظيفة كل مجمع EPS. يتم تطبيق الطرق المختلفة لاستخراج EPS 10-15. ولكن نظرا لتعقيدها الشديد، فإنه يكاد يكون من المستحيل الحصول على جميع عناصر EPS بطريقة واحدة. حتى الآن، لا يوجد "مقاس واحد يناسب الجميع" طريقة لاستخراج EPS. اختيار طريقة استخراج يؤثر ليس فقط على المبلغ الإجمالي، ولكن أيضا على تكوين البوليمرات تعافى 13،16 – 20. اعتمادا على نوع من الحمأة والعائد على السهم من الطرق المختلفة الفائدة المطلوبة.
سوف استخراج البوليمرات تشكيل هلام، واصفا ممتلكاتهم والتحقيق في تفاعلها مع بعضها البعض ومع EPS تشكيل غير هلام يساعد في الكشف عن دور EPS في تشكيل حبيبات الحمأة الهوائية. وعلاوة على ذلك، والبوليمرات تشكيل هلام هي أيضا البوليمرات الحيوية المفيدة في التطبيقات الصناعية. تم إنذار واحد التطبيق الممكن بالفعل باستخدام البوليمرات التي تشكل جل من قسم الخدمات الزراعية كمادة طلاء لزيادة مقاومة للماء ورقة 21.
لذلك، هناك حاجة إلى أساليب الاستخراج ومحددة لربحية السهم تشكيل هلام. والهدف من هذه الدراسة هو وضع منهجية لاستخراج EPS تشكيل هلام من قسم الخدمات الزراعية. ستة طرق استخراج 10-15،22، والتي كثيرا ما تستخدم في الأدب، وقد تم اختيار لاستخراج EPS من قسم الخدمات الزراعية. وتمت مقارنة بمبلغ إجمالي والممتلكات التي تشكل جل من EPS المستخرجة لكل منهجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصريحات للقسم البروتوكول
يوصف استخراج EPS / ALE لحجم 50 مل و 3 غرام من حبيبات. والغرض من هذه القيم والمبادئ التوجيهية. الاستخراج مع تركيزات الحبيبية أعلى يمكن أن تقلل من كمية EPS المستخرج. خلال استخراج الرابطة يجب أن تبقى درجة الحرارة ثابتة عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الوقت اللازم لخليط لتسخين (حوالي 5 دقائق) يتم تضمينها في البروتوكول. وعلاوة على ذلك، تم تعزيز فعالية استخراج باستخدام شريط مغناطيسي من نفس حجم قطر أسفل القارورة. وسيؤدي ذلك إلى خصائص خلط جيدة وآثار طحن، وتعزيز استخراج EPS.
في وقت لاحق في قسم البروتوكول، ويتم تحديد TS وVS غلة كل الاستخراج (طاف جمعها في خطوات 1،1-1،6). يحتاج غسيل الكلى التي يتعين القيام بها قبل TS وVS قياس لتقليل الأخطاء المحتملة بسبب وجود المواد الكيميائية المستخدمة لإخراج. اينصح MWCO من 3500 دا لإزالة هذه المواد الكيميائية مع الحفاظ على الجزيئات EPS داخل كيس غسيل الكلى. يجب أن يكون كيس غسيل الكلى حجم أكبر من حجم استخراج. وهذا أمر ضروري، لأن حجم استخراج ستزيد خلال غسيل الكلى (على سبيل المثال، لاستخراج EDTA تصل إلى 40٪ زيادة الحجم). مدى إزالة الكيميائية لغسيل الكلى يمكن تحديد ذلك عن طريق قياس درجة الحموضة في العينة قبل وبعد غسيل الكلى. بدلا من ذلك، قياسات التوصيل من الماء لغسيل الكلى تظهر مدى إزالة أيون.
للحصول على الرابطة من مجموع استخراج EPS (الخطوات 1.6 و 2) الخطوة غسيل الكلى هو اختياري. ومع ذلك، غسيل الكلى له ثلاث فوائد: أنه يقلل من كمية من حمض الهيدروكلوريك اللازمة لهطول الأمطار، وأنه يحسن نقل الجماعي الحمضية في استخراج ويقلل من نسبة الرماد من الرابطة التي تم الحصول عليها. لهطول الأمطار من الرابطة فمن المستحسن استخدام كوب زجاجي مع حجم أكبر بكثير من المقتطفت. وجرعة زائدة نا 2 CO 3 عادة في استخراج. وحمض الهيدروكلوريك وأضاف سيكون رد فعل لأول مرة مع نا 2 CO 3 اليسار في استخراج، مما أدى إلى تشكيل ثاني أكسيد الكربون، وإذا لم يكن مدال العينة من قبل، في الرغوة. خلال إضافة حمض الهيدروكلوريك، ويجب أن يحرك استخراج ببطء مع شريط مغناطيسي من نفس حجم الجزء السفلي من الكأس. وهناك بقضيب من هذا الحجم والتحريك البطيء يؤدي إلى خلط حتى دون كسر هيكل راسب. إذا لم تتشكل كتل هلام الحمضية في استخراج، ينبغي ملتف الدورق قليلا باليد. ويجري هطول الأمطار مع تركيز الحمض من 1 M لتجنب زيادة حجم كبير للاستخراج في حين لا يزال الحصول على توزيع متجانس للحامض في العينة. يمكن تركيز حمض أعلى يؤدي إلى تشكيل انخفاض الرقم الهيدروجيني الإقليمي وكتل هلام الحمضية. الرقم الهيدروجيني أقل من 2.0 يقلل من كمية الرابطة التي يمكن استردادها، وربما يرجع ذلك إلى التغيرات الهيكليةمن البوليمرات في انخفاض الرقم الهيدروجيني. ولذلك فمن المهم للحفاظ على درجة الحموضة النهائية في 2.20 ± 0.05.
القيود
يهدف طريقة استخراج الرابطة لاستخراج البوليمرات خارج الخلية الهيكلية للEPS من قسم الخدمات الزراعية أو الأغشية الحيوية بشكل عام وليس المقصود لاستخراج جميع EPS الحالية. لاستخراج كل EPS، وهو مزيج من طريقة استخراج أكثر من ضروري. وعلاوة على ذلك، كما هو موضح مع زيادة العائد VS EPS عن طريق تطبيق استخراج مزدوج والرباعي، واستخراج واحد لن استخراج جميع EPS الهيكلية. استخراج الرابطة هو قاس طريقة استخراج EPS، والجمع بين اختلاط مستمر مع ظروف الحرارة والقلوية. لهذا السبب فإنه من الممكن أن بعض المواد داخل الخلايا يتم استخراج جنبا إلى جنب مع EPS. على الرغم من أن تحلل الخلايا يمكن أن تسببها تقنيات استخراج الفيزيائية والكيميائية (صوتنة 31،32، 31،32 هيدروكسيد الصوديوم، EDTA 11،32، CER 32، حرارة 32 والقص عالية أسعار الفائدة بمقدار مترixing 19)، وجود مادة داخل الخلايا في EPS تعافى لا تزال بحاجة إلى التحقق منها. الخاصية تشكيل هلام الأيونية من EPS المستخرجة هي المحور الرئيسي لهذا البحث، إذا كانت EPS تعافى يحتوي لم تحلل المواد داخل الخلايا. وسوف تركز البحوث المستقبلية على تحديد المواد داخل الخلايا في EPS المستخرج.
الانحلال مصفوفة هيدروجيل من قسم الخدمات الزراعية أمر بالغ الأهمية لاستخراج EPS الهيكلية
EPS أشكال كثيفة وصغيرة الحجم مصفوفة هيدروجيل في قسم الخدمات الزراعية. على الرغم من أن EPS تحتوي على فئات مختلفة من الجزيئات العضوية مثل السكريات والبروتينات والأحماض النووية، (الفوسفات) والدهون، والمواد الدبالية وبعض البوليمرات بين الخلايا 7،5،8، لم يكن جميعهم تشكيل مادة هلامية. فقط تعتبر تلك البوليمرات تشكيل هلام هنا كما البوليمرات الهيكلية في EPS.
والهدف من EPS الاستخراج هو إذابة أولا EPS ثم لجمع EPS بالفاعلات. إذا كان EPS الهيكلية (أي تيانه EPS تشكيل هيدروجيل) هو الهدف من استخراج ومصفوفة هلام من قسم الخدمات الزراعية لديها إلى أن تذوب أولا. الطرق الوحيدة التي يمكن إذابة المصفوفة هلام قادرة على استخراج EPS الهيكلية. في هذا البحث، وبعض استخداما EPS أساليب الاستخراج مثل الطرد المركزي 10 – 15، صوتنة 10،14،15، EDTA 10 – 12،14،15، والفورمالديهايد + هيدروكسيد الصوديوم 10 – 15 و الفورماميد + هيدروكسيد الصوديوم 13 لا يمكن عزل بكفاءة الهيكلية EPS. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن مصفوفة هيدروجيل من الحبيبات الهوائية لم بالفاعلات هذه الأساليب هذا. لهذا السبب، اختبارات الثبات في قسم 4 تم القيام بها إلا مع الظروف الحالية في EDTA، الفورماميد + هيدروكسيد الصوديوم والفورمالديهايد + استخراج هيدروكسيد الصوديوم. وكانت هذه قلع ثلاثة يست قادرة على عزل EPS الهيكلية، ولكن لا يزال الحصول على أعلى عائد VS EPS إلى جانب نا 2 CO 3 الاستخراج. شروط سو لم تطبق نا 2 CO 3 استخراج مثل هذه طريقة استخراج بالفاعلات بوضوح مصفوفة قسم الخدمات الزراعية. ومن هنا اعتبرت الشروط المطبقة أثناء الاختبار الاستقرار ممثل.
لا يعتبر استخراج مع راتنج تبادل الأيونات الموجبة (CER)، وآخر كثيرا ما تستخدم طريقة استخراج EPS، لإجراء هذه المقارنة، والدراسات السابقة على استخراج EPS مع خفض الانبعاثات المعتمدة لم تسفر عن نتائج أفضل من عمليات الاستخراج الكيميائية المستخدمة هنا.
هلام تشكيل EPS في قسم الخدمات الزراعية
تعتبر EPS تشكيل هلام مثل EPS الهيكلية في مصفوفة هيدروجيل من قسم الخدمات الزراعية. وتجدر الإشارة إلى أن هناك أنواع مختلفة من الهلاميات المائية مثل الهلام الأيونية، والمواد الهلامية التي يسببها درجة الحرارة والمواد الهلامية درجة الحموضة التي يسببها. وتركز هذه الدراسة فقط على ربحية السهم التي تشكل المواد الهلامية الأيونية. وفيما يتعلق جزء كبير من المواد هلام الهيكلية المستخرجة، وهذا من المرجح أن يكون العائد على السهم الهيكلية المهيمنة. ومن المؤكد أن هناك احتمالات أن أنواع أخرى من EPSهذا الشكل أنواع مختلفة من الهلاميات المائية (على سبيل المثال، ودرجة الحموضة الناجمة هلام 28) موجودة في نفس أو نوع آخر من حبيبات الهوائية. ومع ذلك، بغض النظر عن نوع من هيدروجيل هي المستهدفة، على الانحلال مصفوفة EPS هلام هي أهم خطوة لاستخراج EPS تشكيل هلام.
حاليا، وقد تم ذلك من الأبحاث حول EPS الهيكلية للحمأة الحبيبية. استخراج الرابطة الموصوفة في هذا البروتوكول هو قادر على استخراج EPS تشكيل هلام من قسم الخدمات الزراعية وسوف تستخدم في الدراسات المستقبلية لتوصيف EPS الهيكلية. يحتاج الى مزيد من البحث الذي يتعين القيام به على قسم الخدمات الزراعية، EPS الهيكلية وغير الهيكلية EPS إلى فهم أفضل لعملية وظيفة التحبيب وEPS. خاصة لا بد من التحقيق في النقاط الثلاث التالية: لماذا الكائنات الحية الدقيقة تنتج مثل هذا المبلغ الكبير من EPS، ما هو التركيب الدقيق للEPS وكيفية تكوين EPS تعديل استنادا إلى التغيرات البيئية. كشف وتحليل جميع المركبات المعنية وinteracti بهمسوف إضافات تساعد على فهم الأغشية الحيوية وكيفية استخدامها لصالحنا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was financially supported by the SIAM Gravitation Grant 024.002.002, the Netherlands Organization for Scientific Research and by the Dutch Technology Foundation (STW – Simon Stevin Meester 2013). The authors want to thank Mario Pronk for providing the granular sludge samples.
Materials
| 250 ml baffled flask | Kimble | 25630-250 | |
| 1000 ml glass beaker | VWR | 213-1128 | |
| RCT basic, magnetic stirrer with thermometer | IKA | 3810000 | |
| sodium carbonate decahydrate | Merck KGaA | 1063911000 | |
| 50 ml centrifugation tubes | greiner bio-one | 227261 | |
| Multifuge 1 S-R, centrifuge | Heraeus/Thermo Scientific | – | |
| hydrochloric acid, 37 % | Sigma-Aldrich | 30721-1L-GL-D | |
| 250 ml glass beaker | VWR | 213-1124 | |
| calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 1023821000 | |
| 1 ml Pasteur Pipette | Copan | 201C |
References
- Pronk, M., de Kreuk, M. K., de Bruin, B., Kamminga, P., Kleerebezem, R., van Loosdrecht, M. C. M. Full scale performance of the aerobic granular sludge process for sewage treatment. Water Res. 84, 207-217 (2015).
- Kreuk, M. K., Kishida, N., van Loosdrecht, M. C. M. Aerobic granular sludge – state of the art. Water Sci. Technol. 55 (8-9), 75 (2007).
- Adav, S. S., Lee, D. J., Show, K. Y., Tay, J. H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnol. Adv. 26, 411-423 (2008).
- Seviour, T., Pijuan, M., Nicholson, T., Keller, J., Yuan, Z. Understanding the properties of aerobic sludge granules as hydrogels. Biotechnol. Bioeng. 102 (5), 1483-1493 (2009).
- Flemming, H. -. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Rev. Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
- Seviour, T., Yuan, Z., van Loosdrecht, M. C. M., Lin, Y. Aerobic sludge granulation: A tale of two polysaccharides?. Water Res. 46 (15), 4803-4813 (2012).
- Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. -. C. What are Bacterial Extracellular Polymeric Substances. Microb. Extracell. Polym. Subst. Charact. Struct. Funct. , 27-53 (1999).
- Flemming, H. -. C., Neu, T. R., Wozniak, D. J. The EPS Matrix: The "House of Biofilm Cells.". J. Bacteriol. 189 (22), 7945-7947 (2007).
- Lin, Y. M., Sharma, P. K., van Loosdrecht, M. C. M. The chemical and mechanical differences between alginate-like exopolysaccharides isolated from aerobic flocculent sludge and aerobic granular sludge. Water Res. 47 (1), 57-65 (2013).
- Fang, H. H. P., Jia, X. S. Extraction of extracellular polymer from anaerobic sludges. Biotechnol. Tech. 10 (11), 803-808 (1996).
- Liu, H., Fang, H. H. P. Extraction of extracellular polymeric substances (EPS) of sludges. J. Biotechnol. 95, 249-256 (2002).
- Comte, S., Guibaud, G., Baudu, M. Effect of extraction method on EPS from activated sludge: An HPSEC investigation. J. Hazard. Mater. 140 (1-2), 129-137 (2007).
- Adav, S. S., Lee, D. J. Extraction of extracellular polymeric substances from aerobic granule with compact interior structure. J. Hazard. Mater. 154, 1120-1126 (2008).
- Pan, X., Liu, J., Zhang, D., Chen, X. I., Li, L., Song, W., Yang, J. A comparison of five extraction methods for extracellular polymeric substances (EPS) from biofilm by using three-dimensional excitation-emission matrix (3DEEM) fluorescence spectroscopy. Water SA. 36 (1), 111-116 (2010).
- D’Abzac, P., Bordas, F., Van Hullebusch, E., Lens, P. N. L., Guibaud, G. Extraction of extracellular polymeric substances (EPS) from anaerobic granular sludges: Comparison of chemical and physical extraction protocols. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1589-1599 (2010).
- Comte, S., Guibaud, G., Baudu, M. Relations between extraction protocols for activated sludge extracellular polymeric substances (EPS) and EPS complexation properties: Part I. Comparison of the efficiency of eight EPS extraction methods. Enzyme Microb. Technol. 38 (1-2), 237-245 (2006).
- Adav, S. S., Lee, D. J., Tay, J. H. Extracellular polymeric substances and structural stability of aerobic granule. Water Res. 42, 1644-1650 (2008).
- Caudan, C., Filali, A., Lefebvre, D., Spérandio, M., Girbal-Neuhauser, E. Extracellular polymeric substances (EPS) from aerobic granular sludges: Extraction, fractionation, and anionic properties. Appl. Biochem. Biotechnol. 166 (7), 1685-1702 (2012).
- Frølund, B., Palmgren, R., Keiding, K., Nielsen, P. H. Extraction of extracellular polymers from activated sludge using a cation exchange resin. Water Res. 30 (8), 1749-1758 (1996).
- Nielsen, P. H., Jahn, A. Extraction of EPS. Microb. Extracell. Polym. Subst. Charact. Struct. Funct. , 49-72 (1999).
- Lin, Y. M., Nierop, K. G. J., Girbal-Neuhauser, E., Adriaanse, M., van Loosdrecht, M. C. M. Sustainable polysaccharide-based biomaterial recovered from waste aerobic granular sludge as a surface coating material. Sustain. Mater. Technol. 4, 24-29 (2015).
- Lin, Y. M., Wang, L., Chi, Z. M., Liu, X. Y. Bacterial Alginate Role in Aerobic Granular Bio-particles Formation and Settleability Improvement. Sep. Sci. Technol. 43 (7), 1642-1652 (2008).
- . . Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. , (1998).
- Mchugh, D. J. . A guide to the seaweed industry. , (2003).
- Lin, Y., de Kreuk, M., van Loosdrecht, M. C. M., Adin, A. Characterization of alginate-like exopolysaccharides isolated from aerobic granular sludge in pilot-plant. Water Res. 44 (11), 3355-3364 (2010).
- Zorel, J. A., Aquino, S. F., Sanson, a. L., Castro-Borges, W., Silva, S. Q. Evaluation of EPS extraction protocols from anaerobic sludge for gel-based proteomic studies. Water Sci. Technol. 72 (4), 535 (2015).
- Ruiz-Hernando, M., Cabanillas, E., Labanda, J., Llorens, J. Ultrasound, thermal and alkali treatments affect extracellular polymeric substances (EPSs) and improve waste activated sludge dewatering. Process Biochem. 50 (3), 438-446 (2015).
- Seviour, T., Pijuan, M., Nicholson, T., Keller, J., Yuan, Z. Gel-forming exopolysaccharides explain basic differences between structures of aerobic sludge granules and floccular sludges. Water Res. 43, 4469-4478 (2009).
- de Kerchove, A. J., Elimelech, M. Formation of polysaccharide gel layers in the presenceof Ca2+ and K+ ions: Measurements and mechanisms. Biomacromolecules. 8 (1), 113-121 (2007).
- Jiang, H. L., Tay, J. H., Liu, Y., Tay, S. T. L. Ca2+ augmentation for enhancement of aerobically grown microbial granules in sludge blanket reactors. Biotechnol. Lett. 25 (2), 95-99 (2003).
- Liang, Z., Li, W., Yang, S., Du, P. Extraction and structural characteristics of extracellular polymeric substances (EPS), pellets in autotrophic nitrifying biofilm and activated sludge. Chemosphere. 81 (5), 626-632 (2010).
- Guo, X., Liu, J., Xiao, B. Evaluation of the damage of cell wall and cell membrane for various extracellular polymeric substance extractions of activated sludge. J. Biotechnol. 188, 130-135 (2014).
