Detecção da actividade de dependente do pH<em> Escherichia coli</em> Chaperone HdeB<em> In Vitro</em> e<em> In Vivo</em

Um ambiente natural comum em que agentes patogénicos microbianos experimentar condições de desdobramento da proteína induzida por ácido do estômago de mamífero é (gama de pH 1-4), cujo pH ácido serve como uma barreira eficaz contra agentes patogénicos de origem alimentar ^1. Proteína se desdobrar e agregação, que é causada por protonação cadeia lateral de aminoácido, afecta os processos biológicos, danifica as estruturas celulares e, eventualmente, ^1,2 provoca a morte celular. Uma vez que o pH do periplasma bacteriano equilibra-se quase instantaneamente com o pH do ambiente devido à livre difusão de protões através da membrana exterior porosa, proteínas da membrana periplasmática e interiores das bactérias Gram-negativas são os componentes celulares mais vulneráveis em condições ácidas com o stress ^3. Para proteger sua proteoma periplasmático contra danos mediada pelo ácido rápida, bactérias Gram-negativas utilizar os chaperones peripl�micos ativada por ácido HdeA e HdeB. HdeA é um acompanhante condicionalmente desordenada <sup> 4,5: A um pH neutro, HdeA está presente como um dímero dobrado, a chaperona inactivo. Era uma mudança de pH abaixo de pH 3, função de acompanhante de HdeA é rapidamente activado ^6,7. Ativação de HdeA requer profundas mudanças estruturais, incluindo a sua dissociação em monómeros, e a parcial desdobramento dos monômeros ^6-8. Uma vez activado, HdeA liga-se a proteínas que se desdobram em condições ácidas. Ele evita eficazmente a sua agregação, tanto durante a incubação a pH baixo, bem como mediante a neutralização do pH. Ao retornar para pH 7,0, HdeA facilita a re-enrolamento de suas proteínas clientes de forma ATP-independente e converte de volta em seu dimérica, conformação acompanhá-inativa ^9. Da mesma forma, o HdeB chaperona homóloga também é chaperona inactiva a um pH de 7,0. Ao contrário HdeA, no entanto, a atividade acompanhante de HdeB atinge o seu máximo aparente em pH 4,0, as condições sob as quais HdeB é ainda largamente postas e diméricas ^10. Além disso, reduzindo ainda mais os caus pHes a inativação de HdeB. Estes resultados sugerem que apesar da sua extensa homologia, e HdeA HdeB diferem no seu modo de activação funcional que lhes permite cobrir uma ampla gama de pH com a sua função acompanhante de protecção. Um outro chaperona que tem sido implicado na resistência aos ácidos dos E. coli é o Hsp31 citoplasmática, que aparece para estabilizar proteínas desdobradas cliente até que as condições neutras são restaurados. O modo de acção exacto de Hsp31, no entanto, manteve-se enigmática ^12. Tendo em conta que outras bactérias enteropatogénicas tais como Salmonella falta o operão hdeAB, é muito provável que outros acompanhantes periplásmicos ainda não identificadas podem existir que estão envolvidos na resistência ao ácido destas bactérias ^11.

Os protocolos aqui apresentados permitem monitorizar a actividade de chaperona dependente do pH de HdeB in vitro e in vivo ¹⁰ e pode ser aplicado na investigação de outras chaperonastais como Hsp31. Em alternativa, a rede complexa de factores de transcrição que controlam a expressão de hdeAB pode potencialmente ser investigadas pelo ensaio de stress in vivo. Para caracterizar a função de acompanhante de proteínas in vivo, diferentes configurações experimentais podem ser aplicadas. Um caminho é aplicar condições de estresse desdobramento de proteínas e fenotipicamente caracterizar cepas mutantes que ou sobre-expressam o gene de interesse ou carregam uma deleção do gene. Proteomic estudos podem ser conduzidos para identificar quais as proteínas não agregadas sob condições de stress, quando a chaperona está presente, ou a influência de uma chaperona em uma enzima específica pode ser determinada durante condições de stress, utilizando ensaios enzimáticos ^14-16. Neste estudo, optou-se sobre-expressar HdeB em uma cepa rpoH exclusão, que não tem o fator sigma de choque térmico 32. rpoH controla a expressão de todos os principais E. chaperones coli e sua eliminação é conhecido por aumentar sensitivity a condições de stress ambientais que causam a proteína se desdobrar ^15. A actividade in vivo de chaperona em HdeB foi determinada através da monitorização da sua capacidade para suprimir a sensibilidade da estirpe Δ rpoH pH. Ao todo, os protocolos aqui apresentados fornecem uma abordagem rápida e directa para caracterizar a actividade de uma chaperona activada por ácido in vitro, assim como no contexto in vivo.