Rilevamento del pH-dipendente attività di<em> Escherichia coli</em> Chaperone HdeB<em> In Vitro</em> e<em> In Vivo</em

Un ambiente naturale comune in cui gli agenti patogeni microbici sperimentano proteine condizioni dispiegarsi acido-indotta è lo stomaco dei mammiferi (intervallo di pH 1-4), il cui pH acido serve come una barriera efficace contro gli agenti patogeni di origine alimentare ^1. Proteine dispiegarsi e aggregazione, che è causato da protonazione catena laterale di aminoacidi, colpisce processi biologici, danni strutture cellulari e alla fine provoca la morte delle cellule ^1,2. Poiché il pH del periplasma batterico equilibra quasi istantaneamente con il pH ambientale dovuto alla diffusione libera di protoni attraverso la membrana esterna porosa, proteine di membrana periplasmatiche ed interne di batteri Gram-negativi sono i componenti cellulari più vulnerabili in condizioni acido-stress ^3. Per proteggere il loro proteoma periplasmic contro il Rapid danni da acido-mediata, batteri Gram-negativi utilizzano gli accompagnatori periplasmatiche acido attivato HdeA e HdeB. HdeA è un chaperone condizionalmente disordinati <sup> 4,5: A pH neutro, HdeA è presente come, dimero chaperone-inattiva piegato. C'era una variazione del pH pH inferiore a 3, la funzione di accompagnatore HdeA è rapidamente attivato ^6,7. L'attivazione di HdeA richiede profondi cambiamenti strutturali, tra cui la sua dissociazione in monomeri, e parziale che si svolgevano dei monomeri ^6-8. Una volta attivato, HdeA si lega alle proteine ​​che si svolgono in condizioni acide. Si previene efficacemente la loro aggregazione sia durante l'incubazione a pH basso così come su pH di neutralizzazione. Al ritorno a pH 7,0, HdeA facilita il ripiegamento delle proteine cliente in forma di ATP-indipendenti e converte di nuovo nella sua dimerica, conformazione chaperone-inattiva ^9. Allo stesso modo, il chaperone HdeB omologa è anche chaperone-inattivo a pH 7,0. A differenza HdeA, tuttavia, l'attività di accompagnatore HdeB raggiunge il suo massimo apparente a pH 4.0, condizioni in cui HdeB è ancora in gran parte piegata e dimerici ^10. Inoltre, abbassando ulteriormente le Caus pHes l'inattivazione di HdeB. Questi risultati suggeriscono che, nonostante la loro ampia omologia, HdeA e HdeB differiscono nella loro modalità di attivazione funzionale che permette loro di coprire un ampio intervallo di pH con la loro funzione protettiva chaperone. Un altro accompagnatore che è stato implicato nella resistenza agli acidi di E. coli è il citoplasmatica Hsp31, che sembra stabilizzarsi proteine clienti ripiegate fino a condizioni neutre vengono ripristinati. La modalità d'azione preciso di Hsp31, tuttavia, è rimasto enigmatico ^12. Dato che altri batteri enteropatogeni come Salmonella mancano dell'operone hdeAB, è molto probabile che potrebbero esistere altri accompagnatori periplasmatiche ancora non identificati che sono coinvolti nella resistenza agli acidi di questi batteri ^11.

I protocolli qui presentati consentono di monitorare l'attività chaperone pH-dipendente di HdeB in vitro e in vivo ¹⁰ e possono essere applicati per investigare altri accompagnatoriquali Hsp31. In alternativa, la complessa rete di fattori di trascrizione che controllano l'espressione di hdeAB può potenzialmente essere studiata con il test di stress in vivo. Per caratterizzare la funzione delle proteine chaperone in vivo, diverse configurazioni sperimentali possono essere applicati. Una via è quella di applicare proteine ​​dispiegarsi condizioni di stress e fenotipicamente caratterizzare ceppi mutanti che o iperesprimono il gene di interesse o portare una delezione del gene. Studi di proteomica possono essere condotti per identificare quali proteine non è più aggregato in condizioni di stress quando il chaperone è presente, o l'influenza di un accompagnatore su un enzima specifico può essere determinato in condizioni di stress utilizzando saggi enzimatici ^14-16. In questo studio, abbiamo scelto di iperespressione HdeB in un ceppo rpoH cancellazione, a cui manca il fattore sigma shock termico 32. RpoH controlla l'espressione di tutti i principali E. accompagnatori coli e la sua eliminazione è noto per aumentare sensitivity a condizioni di stress ambientali che causano la proteina dispiegarsi ^15. Il vivo l'attività di chaperone di HdeB è stata determinata monitorando la sua capacità di sopprimere la sensibilità pH del ceppo Δ rpoH. Complessivamente, i protocolli qui presentati forniscono un approccio veloce e semplice per caratterizzare l'attività di un chaperone acido attivato in vitro e nel contesto in vivo.