Hızlı Bir adım enzimatik sentezi ve Trehaloz Analoglarının All-sulu Arıtma
Summary
Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.
Abstract
Kimyasal trehaloz veya trehaloz analogları sürümlerini değiştirilmiş, diğer alanlar arasında biyoloji, biyoteknoloji ve ilaç bilimi uygulamaları var. Örneğin, tespit etiketleri taşıyan trehaloz analoglan Mycobacterium tuberculosis tespit etmek için kullanılmıştır ve tüberküloz tanısal görüntüleme maddeleri gibi uygulamalar olabilir. trehalozun hidrolitik olarak kararlı versiyonları da bağlı kalorisiz tatlandırıcılar ve Bio koruyucu maddeler olarak kullanım için potansiyel takip edilmektedir. Çeşitli uygulamalar için bileşikler sınıfının itiraz rağmen, potansiyel nedeniyle bunların üretimi için güçlü bir yol olmadığı için tamamlanmamış kalır. Burada, kimyasal sentez ile ilgili sorunlarını ortadan trehaloz analoglarının hızlı ve etkili bir tek-aşamalı biyokatalitik sentezi için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Thermoproteus Tenax gelen ısı ayarlı trehaloz sintaz (tRet) enzimini kullanarak, trehaloz analoglan generat olabilirEd glükoz analogları ve yüksek verimle üridin difosfat glukozdan tek bir aşamada (kantitatif dönüşüme kadar) 15-60 dakika içinde. sıkma diyaliz ve iyon değişim oluşur basit ve hızlı bir sigara kromatografik saflaştırma protokolü gibi az 45 dakika içinde sulu bir çözelti içinde bilinen konsantrasyonda bir çok trehaloz analoglarını sağlayabilir. reaksiyona girmemiş glükoz analoğu hala devam durumlarda, trehaloz analog ürününün kromatografik saflaştırması gerçekleştirilebilir. Genel olarak, bu yöntem olup, özelliği kimyagerler etkin ve erişilebilir hızlandırılmış sentezi ve trehaloz analogları saflaştırılması için bir "yeşil" biyokatalitik bir platform sağlar. Bu yöntemin uygulanabilirliği örnek için, sentez seyahati sulu arıtma bir protokol açıklar ve mikobakterilerin floresens az 1 saat sürdü ve etkinleştirilmiş her biri mikobakteriler için trehaloz-bazlı tıklama kimyası prob uygulanması. Gelecekte, oth arasında, o tasavvurUygulamalar er, bu protokol, tüberküloz teşhis için trehaloz-bazlı prob hızlı sentezi uygulanabilir. Böyle pozitron emisyon tomografisi-bilgisayarlı tomografi (PET-BT) olarak (örneğin, 18 F-modifiye trehaloz) ileri klinik görüntüleme yöntemleri için kullanılan olabilir Örneğin, kısa ömürlü radyonüklid modifiye trehaloz analogları.
Introduction
Trehaloz, bir 1,1-α, α-glikosidik bağ (Şekil 1A) ile bağlanmış iki glukoz gruplarından oluşan simetrik indirgeyici olmayan disakkarittir. Trehaloz, insan ve diğer memelilerde eksik olsa da, bakteri, mantar, bitki ve omurgasız 1 yaygın olarak bulunur. En organizmalarda trehaloz birincil rolü, kuruma 1 ile çevresel strese karşı korumaktır. Buna ek olarak, bazı insan patojenleri hücre kılıfı sentezi bir aracısı olarak ve bağışıklık glikolipitler 2 yapımı için bir yapı bloğu olarak trehaloz kullanan tuberculosis neden Mycobacterium tuberculosis dahil olmak üzere, hastalık oluşturma etkisi için trehaloz gerektirir.
Şekil 1: Trehaloz, trehaloz analogları. (AX, yapısal değişiklik doğal trehaloz ve doğal olmayan bir trehaloz analog, bir) Yapıları. Bio ve bio potansiyel uygulamalara sahip literatürde trehaloz analogları (B) Örnekler.
Kendine özgü yapısı ve fizyolojik fonksiyonları, trehaloz mantıksal biyo (tekno) kullanım ve biyomedikal uygulamalarda 3 önemli dikkat çekti. Doğa-örneğin gözlenen trehaloz koruyucu özellikleri, çarpıcı yeteneği 4 sahibi olur Biyokoruma uygulamalarında geniş kullanım mahmuzlu aşırı dehidratasyon uğramıştır "diriliş" Bitkilerde yaşam sürdürebilmek yardımcı olur. Trehaloz, örneğin nükleik asitler, proteinler, hücre ve doku 3 arasındaki biyolojik örnekler, geniş bir dizi korumak için kullanılmıştır. Örneğin, trehaloz ilaç t sayısında bir stabilize edici katkı maddesi olarak kullanılırşapka birçok anti-kanser monoklonal antikorlar 3 olmak üzere, piyasada bulunmaktadır. Yanı sıra, trehaloz gıda sektöründe tatlandırıcı olarak kullanılır ve bu kapsamlı hem gıda ve kozmetik sanayiinde ürün korunması için kullanılır. Ticari Bu tür uygulamalar için trehaloz kabul ilk doğal kaynaklardan ya da sentez yoluyla saf trehaloz toplu miktarlarının elde edilmesi için yetersizlik ile sınırlıydı. Bununla birlikte, nişasta trehaloz ekonomik üretimi için etkin bir enzimatik proses son zamanlarda yaygın ticari kullanımı teşvik ettiği geliştirilmiştir 5.
6; kimyasal trehaloz değiştirilmiş türevleri, (Şekil 1B de gösterilen trehaloz analoglarının spesifik örnekleri, genel yapısı Şekil 1A'da gösterilen), çeşitli uygulamalar için giderek artan bir ilgi kazanmıştır, trehaloz analogları olarak adlandırılan. Örneğin, lakto-trehaloz böylece 4-pozisyonunda hidroksil grubu, bir ters stereokimyasal konfigürasyona sahiptir, galaktoz ile ikame onun glikoz birimleri ile bir trehaloz analogudur. Lacto-Trehaloz aynı stabilize edici özelliklere sahip fakat kalorisiz gıda katkı maddesi 6, 7 gibi cazip hale bağırsak enzimleri bozunmaya karşı dayanıklı olmaktadır.
trehaloz analogları Bizim Grubun faiz öncelikle mikobakteriler-spesifik problar ve inhibitörleri olarak değeri ile ilgilidir. Barry ve Davis grupları floresan mikroskobu 8 tarafından algılama sağlayan metabolik canlı M. tuberculosis hücre duvarını etiketlemek için gösterilen FITC-keto-trehaloz adında bir floresan konjuge keto-trehaloz analog, geliştirdi. BERTOZZI laboratuvar metabolik det olmak sonradan hücre duvarını etiket olabilir ve küçük azido-trehaloz (TreAz) analogları geliştirdiyansıtılmaktadır tıklama kimya ve floresan analizi 9 kullanarak. Bu gelişmeler, tüberküloz için tanısal görüntüleme maddeleri olarak trehaloz-dayanan problar kullanılarak olasılığına işaret etmektedir. Trehaloz analogları da canlılığı ve ölümcüllüğün 10, 11, 12 için gerekli olan bakteri yollarının bozmaya nedeniyle potansiyel M. tuberculosis inhibitörleri olarak takip edilmiştir.
Şimdiye kadar, biyo (tekno) mantıksal ve biyomedikal uygulamalar için trehaloz analogları geliştirmek için ana engel verimli sentetik yöntemlerin olmaması. Trehaloz analogları üreten iki geleneksel yolları kimyasal sentez üzerinde (Şekil 2) güveniyor. Diğer düzgün fonksiyonelleştirilmiş monosakkarit yapı taşları ile başlayan ve kimyasal glikosilasyonu kullanılmasını içermektedir ise bir rota, doğal trehalozun desymmetrization / modifikasyonunu içerir1,1-α, α-glikosidik bağ oluşturmak. En son derlemelerde 13, 14 tartışılmıştır Bu yaklaşımlar, M. tuberculosis 15 bu tür sulfolipid-1 gibi kompleks bir trehaloz içeren doğal ürünler, küçük miktarlarda çok adımlı bir sentez gerçekleştirilmesi için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, her iki yaklaşım olmayan kimyagerler genellikle zaman alıcı, verimsiz erişilemez ve buna ek olarak, çevre dostu olarak kabul edilmez. Bu nedenle, trehaloz analoglarının belirli türleri sentezlenmesi için, bu stratejiler ideal değildir.
Şekil 2: trehaloz analog sentezi Yaklaşımlar. Kimyasal solda gösterilen, trehaloz analog sentezi yaklaşımlar, zor korumanız içeren çok adımlı prosedürleri kullanmakma / korumanın kaldırılması, desymmetrization ve / veya glikosilasyon adımları. sağda gösterilen enzimatik sentezi, stereoselektif olarak, sulu çözelti içinde analogları trehaloza basit korumasız substratlar dönüştürme enzim (ler) kullanır. Burada rapor enzimatik protokolü tek bir aşamada trehaloz analogları glikoz analogları ve UDP-glikoz dönüştürmek için bir trehaloz sintaz (tRet) enzimini kullanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
trehaloz analogları etkin bir biyokatalitik rota moleküllerinin bu umut verici sınıfının üretim, değerlendirme ve uygulama kolaylaştıracaktır. Trehaloz üretimi 5 ticari enzimatik işlem, bir alt-tabaka olarak nişasta kullandığı için analoglarını sentez için uyumlu değildir, diğer biyosentetik yolu vardırtrehaloz analog sentezi için istismar edilebilir doğada yolları. Ancak, son zamanlarda 6 gözden geçirilmiştir, bu alanda, araştırma, sınırlı olmuştur. Bir rapor ilgili floro-glikoz tek floro-trehaloz analog ulaşmak için Escherichia coli trehaloz biyosentetik yolunun esinlenerek bir yöntem kullanılır. Bununla birlikte, bu yaklaşım, verimlilik ve genelliğini 8 sınırlı üç enzim sistemi gerektirir. Araştırılmış olan bir başka yaklaşım, ilke olarak glükoz analogları ve glükoz-1-fosfat 6, 16, 17 trehaloz analoglarının bir-adımlık sentez izin ters yönde, trehaloz fosforilaz (TREP) kullanmaktır. Bu yaklaşım, gelecekte söz var olsa da, her ikisi de eviren ve istinat TrePs şu anda analog sentezi için dezavantajları var. Örneğin, tersini TrePs yasaklı deneyimlerini varnsive verici molekül (β-D-glikoz 1-fosfat) ve tutma TrePs düşük enzim sentezleme verimler / kararlılık ve belirli alt-tabaka karışıklık sahiptir. (Enzim mühendisliği yoluyla, örneğin) önemli gelişmeler TREP-aracılı analog sentezi önce gerekli olacak pratik.
Şu anda, trehaloz analoglarının enzimatik sentezi için en pratik yaklaşım, kan şekeri ve üridin difosfat (UDP), tek bir aşama 6'da trehaloza -glükoz dönüştüren bir trehaloz sintaz (tRet) enzimi kullanılmasıdır. Son zamanlarda glükoz analogları ve UDP-glikoz (Şekil 3) 19 trehaloz analoglarını sentez -to Thermoproteus Tenax tRet-termostabil ve tek yönlü enzim 18 kullanımını bildirmiştir. Bu enzim sadece sentetik yönde çalışır ve TREP sisteminde bulunan trehaloz bozulması problemini önler. Bu tek-aşamalı bir reaksiyon coul1 saat içinde tamamlanması d ve hazır glükoz analoğu substratlar (Örnek Sonuçlar Tablo 1 den (yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile tespit edildiği üzere>% 99 kadar) trehaloz analogları geniş bir çeşitliliği yüksek verimde erişilen Bölüm).
Şekil 3: trehaloz analoglarının tRet katalizörlü tek aşamalı sentezi. T. Tenax gelen Tret enzimi stereoselektif tek adımda trehaloz analogları oluşturmak için hazır glikoz analogları ve UDP-glikoz katılabilirsiniz. R1 -R4 dün = Değişken yapısal değişiklik, örneğin, azido, floro, deoksi, tiyo, stereokimyasal veya izotopik etiketli modifikasyon; Y, örneğin, oksijen ya da kükürt ya da izotopik olarak etiketlenmiş heteroatom değişken heteroatom, =.
Burada, biz reklamı sağlamaktRet reaksiyon koşulları optimize E.coli'den ekspresyonu ve tRet saflaştırılması dahil olmak üzere, tRet sentez işlemi için etailed protokol, ve sulu faz içinde tamamen gerçekleştirilir geliştirilmiş bir saflaştırma yöntemi. Bu modifiye protokol, yarı-preparatif skala (10-100 mg) üzerinde, çeşitli trehaloz benzerlerinin uygun ve verimli bir sentezi ve saflaştırılması sağlar. Biz de hazırlanması ve mikobakteri hücrelerin hızlı floresan algılama özellikli az 1 saat, mikobakterinin bir trehaloz tabanlı prob uygulanması için bu protokolün kullanımını göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trehaloz analogları gıda ve ilaç korunması mikrobiyal enfeksiyonların 6 tanı ve tedavi, çeşitli alanları etkileme potansiyeline sahiptir. Mevcut çok basamaklı kimyasal sentez yöntemi (doğal karmaşık mikobakteriyel glikolipitler ortaya çıkan gibi) modifikasyon birden fazla site kompleks trehaloz analoglarını üretmek için de yararlıdır. Bununla birlikte, bu yöntemler, nispeten basit bir tekli ikame edilmiş trehaloz analogları 9, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the National Institutes of Health (R15 AI117670) to B.M.S and P.J.W, as well as a Cottrell College Scholar Award from the Research Corporation (20185) to P.J.W. L.M.M. was supported by a Provost’s Fellowship from CMU.
Materials
| LB agar | Research Products International | L24021 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| Luria broth | Research Products International | L24045 | |
| Terrific Broth | Research Products International | T15050 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A3256 | |
| Phosphate-buffered Saline | GE Healthcare | SH30256 | |
| Imidazole | Sigma Aldrich | I5513 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286 | |
| Sodium phosphate, | Fisher Scientific | S374 | |
| monobasic | |||
| Syringe filter, 0.45 µm | Fisher Scientific | 09719D | |
| Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free | Thermo Scientific | 88666 | |
| HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| TRIS base ultrapure | Research Products International | T60040 | |
| Dialysis tubing, MWCO 12–14,000 | Fisher Scientific | 21-152-16 | |
| Glucose analogues | CarboSynth, | Examples of vendors that offer numerous glucose analogues | |
| Sigma Aldrich, | |||
| Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals | |||
| 6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz) | CarboSynth | MA02620 | |
| UDP-Glucose | abcam Biochemicals | ab120384 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher Scientific | M33 | |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit | EMD Millipore | UFC901008 | |
| Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin | Bio-Rad | 444-9999 | |
| Extra-Fine Bio-Gel P2 media | Bio-Rad | 150-4118 | |
| Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates | EMD Millipore | 1056280001 | |
| n-Butanol | Fisher Scientific | A399 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | S25310A | |
| Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300 | |
| Acetonitrile | EMD Millipore | AX0145 | |
| Deuterium oxide, 99.8% | Acros Organics | 351430075 | |
| Aminopropyl HPLC column | Sigma Aldrich | 58338 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Para-formaldehyde | Ted Pella | 18505 | |
| Alkyne-488 | Sigma Aldrich | 761621 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Click Chemistry Tools | 1061 | |
| tert-Butanol | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | W387520 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotechnology | 10001 |
References
- Elbein, A. D., Pan, Y. T., Pastuszak, I., Carroll, D. New insights on trehalose: a multifunctional molecule. Glycobiology. 13, 17-27 (2003).
- Tournu, H., Fiori, A., Van Dijck, P. Relevance of trehalose in pathogenicity: some general rules, yet many exceptions. PLoS Pathog. 9, 1003447 (2013).
- Ohtake, S., Wang, Y. J. Trehalose: Current use and future applications. J. Pharm. Sci. 100, 2020-2053 (2011).
- Adams, R. P., Kendall, E., Kartha, K. K. Comparison of free sugars in growing and desiccated plants of Selaginella lepidophylla. Biochem. Syst. Ecol. 18, 107-110 (1990).
- Kubota, M., Ohnishi, M. . Glycoenzymes. , (2000).
- Walmagh, M., Zhao, R., Desmet, T. Trehalose analogues: latest insights in properties and biocatalytic production. Int. J. Mol. Sci. 16, 13729-13745 (2015).
- Kim, H. -. M., Chang, Y. -. K., Ryu, S. -. I., Moon, S. -. G., Lee, S. -. B. Enzymatic synthesis of a galactose-containing trehalose analogue disaccharide by Pyrococcus horikoshii trehalose-synthesizing glycosyltransferase: Inhibitory effects on several disaccharidase activities. J. Mol. Catal. B: Enzym. 49, 98-103 (2007).
- Backus, K. M., et al. Uptake of unnatural trehalose analogs as a reporter for Mycobacterium tuberculosis. Nat. Chem. Biol. 7, 228-235 (2011).
- Swarts, B. M., et al. Probing the mycobacterial trehalome with bioorthogonal chemistry. J. Am. Chem. Soc. 134, 16123-16126 (2012).
- Rose, J. D., et al. Synthesis and biological evaluation of trehalose analogs as potential inhibitors of mycobacterial cell wall biosynthesis. Carbohydr. Res. 337, 105-120 (2002).
- Wang, J., et al. Synthesis of trehalose-based compounds and their inhibitory activities against Mycobacterium smegmatis. Bioorg. Med. Chem. 12, 6397-6413 (2004).
- Gobec, S., et al. Design, synthesis, biochemical evaluation and antimycobacterial action of phosphonate inhibitors of antigen 85C, a crucial enzyme involved in biosynthesis of the mycobacterial cell wall. Eur. J. Med. Chem. 42, 54-63 (2007).
- Sarpe, V. A., Kulkarni, S. S. Regioselective protection and functionalization of trehalose. Trends in Carbohydr. Res. 5, 8-33 (2013).
- Chaube, M. A., Kulkarni, S. S. Stereoselective construction of 1,1-alpha,alpha-glycosidic bonds. Trends in Carbohydr. Res. 4, 1-19 (2013).
- Leigh, C. D., Bertozzi, C. R. Synthetic studies toward Mycobacterium tuberculosis sulfolipid-I. J. Org. Chem. 73, 1008-1017 (2008).
- Chaen, H., et al. Efficient enzymatic synthesis of disaccharide, alpha-D-galactosyl-alpha-D-glucoside, by trehalose phosphorylase from Thermoanaerobacter brockii. J. Appl. Glycosci. 48, 135-137 (2001).
- Vander Borght, J., Soetaert, W., Desmet, T. Engineering the acceptor specificity of trehalose phosphorylase for the production of trehalose analogs. Biotechnol. Progr. 28, 1257-1262 (2012).
- Kouril, T., Zaparty, M., Marrero, J., Brinkmann, H., Siebers, B. A novel trehalose synthesizing pathway in the hyperthermophilic Crenarchaeon Thermoproteus tenax: the unidirectional TreT pathway. Arch. Microbiol. 190, 355-369 (2008).
- Urbanek, B. L., et al. Chemoenzymatic synthesis of trehalose analogues: rapid access to chemical probes for investigating mycobacteria. ChemBioChem. 15, 2066-2070 (2014).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2596-2599 (2002).
- Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
- Kalscheuer, R., Weinrick, B., Veeraraghavan, U., Besra, G. S., Jacobs, W. R. Trehalose-recycling ABC transporter LpqY-SugA-SugB-SugC is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 21761-21766 (2010).
