Rápida de un solo paso Síntesis enzimática y All-Purificación acuosa de trehalosa Análogos

La trehalosa es un disacárido simétrico no reductor que consiste en dos fracciones de glucosa que están unidas por un 1,1-α, enlace α-glucosídico (Figura 1A). Mientras que la trehalosa está ausente de los seres humanos y otros mamíferos, que se encuentra comúnmente en las bacterias, los hongos, las plantas y los invertebrados ^1. La función principal de trehalosa en la mayoría de los organismos es proteger contra el estrés ambiental, como la desecación ^1. Además, algunos patógenos humanos requieren trehalosa para la virulencia, incluyendo la tuberculosis Mycobacterium tuberculosis que causa, que utiliza trehalosa como un mediador de la biosíntesis de envoltura celular y como un bloque de construcción para la construcción de glicolípidos inmunomoduladores ^2.

Figura 1: La trehalosa y análogos de trehalosa. (A) Estructuras de trehalosa natural y un análogo no natural de trehalosa, en donde X es una modificación estructural. (B) Ejemplos de análogos de trehalosa en la literatura que tienen aplicaciones potenciales en biopreservación y bioimagen.

Debido a su singular estructura y las funciones fisiológicas, trehalosa ha llamado la atención significativa para su uso en bio (tecno) lógico y aplicaciones biomédicas ^3. Las propiedades protectoras de la trehalosa se observa en la naturaleza- por ejemplo, su capacidad de ataque para ayudar a mantener la vida en las plantas "resurrección" que se han sometido a la deshidratación extrema ⁴ -tienen estimuló su amplio uso en aplicaciones biopreservación. La trehalosa se ha utilizado para conservar una gran variedad de muestras biológicas, tales como ácidos nucleicos, proteínas, células y tejidos ^3. Por ejemplo, la trehalosa se utiliza como un aditivo estabilizador en una serie de productos farmacéuticos tsombrero están en el mercado, incluyendo varios anticuerpos monoclonales anti-cáncer ^3. Además, la trehalosa se usa como edulcorante en la industria alimentaria, y se utiliza ampliamente para la conservación del producto en las industrias de alimentos y cosméticos. La adopción de la trehalosa para estos tipos de aplicaciones comerciales se inicialmente limitada por la incapacidad de obtener grandes cantidades de trehalosa pura a partir de fuentes naturales o mediante síntesis. Sin embargo, un proceso enzimático eficaz para la producción económica de trehalosa a partir de almidón se ha desarrollado recientemente, que ha estimulado su uso comercial generalizado ^5.

Derivados de trehalosa químicamente modificado, denominado en este documento como análogos de trehalosa, han ganado cada vez más atención para diversas aplicaciones (estructura genérica muestra en la Figura 1A; ejemplos específicos de análogos de trehalosa que se muestran en la Figura 1B) ⁶. Por ejemplo, lacto-trehalosa es un análogo de trehalosa con una de sus unidades de glucosa sustituidos con galactosa, de este modo el grupo hidroxilo posición 4 tiene una configuración estereoquímica invertida. Lacto-trehalosa tiene las mismas propiedades estabilizantes como trehalosa, pero es resistente a la degradación por enzimas intestinales, por lo que es atractivo como un aditivo alimentario no calórico ^{6, 7.}

El interés de nuestro grupo de análogos de trehalosa se refiere principalmente a su valor como sondas y los inhibidores de micobacterias-específica. Los grupos Barry y Davis desarrollaron un análogo ceto-trehalosa conjugada con fluoresceína, llamada FITC-ceto-trehalosa, que se mostró para etiquetar metabólicamente la pared celular de M. tuberculosis vivo, lo que permite su detección por microscopía de fluorescencia ^8. El laboratorio Bertozzi desarrollado más pequeño azido-trehalosa (TreAz) análogos que podría etiquetar metabólicamente la pared celular y, posteriormente, ser deteja usando química de clic y el análisis de fluorescencia ^9. Estos avances apuntan a la posibilidad de utilizar sondas basadas en trehalosa como agentes de formación de imágenes de diagnóstico para la tuberculosis. Análogos de trehalosa se han perseguido también como inhibidores de M. tuberculosis debido a su potencial para perturbar vías en la bacteria que son esenciales para la viabilidad y virulencia ^{10, 11, 12.}

Hasta ahora, el principal obstáculo para el desarrollo de análogos de trehalosa para aplicaciones biológicas y biomédicas lógicos (tecno) es la falta de métodos sintéticos eficientes. Las dos rutas tradicionales a la producción de análogos de trehalosa se basan en la síntesis química (Figura 2). Una vía implica desimetrización / modificación de trehalosa natural, mientras que la otra consiste en partir de bloques de construcción de monosacáridos adecuadamente funcionalizados y la realización de glicosilación química paraforjar el 1,1-α, α-glucosídico vínculo. Estos enfoques, que recientemente han sido discutidos en artículos de revisión ^{13, 14,} han demostrado ser útiles para llevar a cabo la síntesis de múltiples pasos de pequeñas cantidades de productos naturales que contienen trehalosa complejos, como sulfolípidos-1 de M. tuberculosis ^15. Sin embargo, ambos enfoques son generalmente ineficientes, que consume tiempo, inaccesible a los no-químicos, y, además, no se consideran para ser amigable con el medio ambiente. Por lo tanto, para la síntesis de ciertos tipos de análogos de trehalosa, estas estrategias no son ideales.

Figura 2: Enfoques para la síntesis de trehalosa analógica. Químicas para la síntesis de trehalosa analógica, que se muestra a la izquierda, utilice los procedimientos de varios pasos que implican difíciles protecciónpasos ción / desprotección, desimetrización, y / o glicosilación. Síntesis enzimática, que se muestra a la derecha, utiliza la enzima (s) para convertir estereoselectivamente sustratos simples, no protegidos a los análogos de la trehalosa en solución acuosa. El protocolo enzimática informado en el presente documento utiliza una enzima trehalosa sintasa (TRET) para convertir análogos de glucosa y UDP-glucosa en análogos de trehalosa en un solo paso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Una ruta biocatalıtica eficiente a los análogos de trehalosa facilitaría la producción, evaluación y aplicación de esta prometedora clase de moléculas. Mientras que el proceso enzimático comercial para la producción de trehalosa ⁵ no es adaptable a la síntesis de análogos, ya que utiliza almidón como sustrato, hay otro camino biosintéticoformas en la naturaleza que pueden ser explotadas para la síntesis de trehalosa analógica. Sin embargo, la investigación en esta área, que ha sido recientemente revisado ^6, ha sido limitado. En un informe se utiliza un método inspirado en la ruta de biosíntesis de trehalosa Escherichia coli acceder a un único análogo fluoro-trehalosa a partir del correspondiente fluoro-glucosa. Sin embargo, este enfoque requiere un sistema de tres enzimas que ha eficiencia y generalidad ⁸ limitado. Otro enfoque que se ha explorado es utilizar fosforilasa trehalosa (TREP) en la dirección inversa, que, en principio, permite la síntesis de una sola etapa de los análogos de trehalosa a partir de análogos de glucosa y glucosa-1-fosfato de ^{6, 16, 17.} Aunque este enfoque puede tener un futuro prometedor, tanto la inversión y la retención Treps actualmente tienen inconvenientes para la síntesis analógica. Por ejemplo, Treps inversoras tienen una expe prohibitivamentemolécula nsive donante (β-D-glucosa 1-fosfato) y Treps de retención tienen pobres rendimientos de expresión enzima / estabilidad y la promiscuidad de sustrato limitada. Se necesitarán mejoras significativas (por ejemplo, a través de ingeniería de enzimas) antes de la síntesis analógica mediada por TREP es práctico.

En la actualidad, el enfoque más práctico para la síntesis enzimática de los análogos de trehalosa es el uso de una enzima trehalosa sintasa (TRET), que convierte la glucosa y la uridina difosfato (UDP) -glucosa en trehalosa en un solo paso ^6. Recientemente hemos informado de la utilización de Thermoproteus tenax TRET-una enzima termoestable y unidireccional ^18: para sintetizar análogos de trehalosa a partir de análogos de glucosa y UDP-glucosa (Figura 3) ^19. Esta enzima solamente opera en la dirección sintético y evita el problema de la degradación de trehalosa se encuentra en el sistema TREP. Este coul reacción de una etapad completará en 1 hora, y se accede a una amplia variedad de análogos de trehalosa con un alto rendimiento (hasta> 99% según se determinó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)) a partir de sustratos análogos de glucosa fácilmente disponibles (véase la Tabla 1 en los resultados representativos sección).

Figura 3: catalizada por TRET síntesis de una sola etapa de los análogos de trehalosa. La enzima TRET de T. tenax puede unirse de manera estereoselectiva análogos de glucosa fácilmente disponibles y UDP-glucosa para formar análogos de trehalosa en un solo paso. R ¹ -R ⁴ = modificación estructural variable, por ejemplo azido, fluoro-, desoxi-, tio-, estereoquímica, o modificaciones de etiquetas isotópicas; Y = heteroátomo variable, por ejemplo oxígeno o azufre, o heteroátomo marcado isotópicamente.

Aquí, proporcionamos anuncioprotocolo etailed para el proceso de síntesis TRET, incluyendo la expresión y purificación de TRET de E. coli, optimizado las condiciones de reacción TRET, y un método de purificación mejorado que se lleva a cabo en su totalidad en la fase acuosa. Este protocolo modificado permite la síntesis conveniente y eficiente y la purificación de diversos análogos de trehalosa en una escala semi-preparativa (10-100 mg). También demostramos el uso de este protocolo para la preparación y administración de una sonda a base de trehalosa para micobacterias en menos de 1 hora, lo que permitió la detección de fluorescencia rápida de células micobacterianas.