Быстрое Одношаговый ферментативный синтез и All-водный Очистка трегалозных Аналогов

Трегалоза представляет собой симметричную невосстанавливающих дисахарид , состоящий из двух глюкозных остатков, которые соединены с помощью 1,1-a, α-гликозидной связи (фиг.1А). В то время как трегалоза отсутствует у людей и других млекопитающих, он встречается обычно у бактерий, грибов, растений и беспозвоночных животных ^1. Основная роль трегалозы в большинстве организмов является защита от экологических стрессов, таких как высыханию ^1. Кроме того, некоторые патогены человека требуют трегалозу вирулентности, в том числе туберкулеза , вызывающих микобактерий туберкулеза, который использует трегалозу в качестве медиатора биосинтеза клеточной оболочки и в качестве строительного блока для строительства иммуномодулирующих гликолипидов ^2.

Рисунок 1: Трегалозы и трегалоза аналоги. (A) Структуры натурального трегалозы и неестественным трегалозной аналог, где Х представляет собой структурную модификацию. (B) Примеры аналогов трегалозных , описанных в литературе , которые имеют потенциальное применение в biopreservation и биоимиджинга.

Благодаря своей уникальной структуре и физиологических функций, трегалоза привлекла значительное внимание для использования в био (техно) логических и биомедицинских приложений ^3. Защитные свойства трегалозы , наблюдаемого в например , природа – , его поразительная способность помогать поддерживать жизнь в «воскрешения» растений, которые подверглись крайнее обезвоживание ⁴ -Иметь стимулировало его широкое применение в biopreservation приложениях. Трегалозы использовался для сохранения широкого спектра биологических образцов, таких как нуклеиновые кислоты, белки, клетки, ткани и ^3. Например, трегалоза используется в качестве стабилизирующей добавки в ряде фармацевтических тшляпы находятся на рынке, в том числе несколько противораковых моноклональных антител ^3. Как хорошо, трегалоза используется в качестве подсластителя в пищевой промышленности, и он широко используется для сохранения продукта как в пищевой и косметической промышленности. Принятие трегалозы для этих типов коммерческих приложений был изначально ограничена невозможностью получить достаточные количества чистого трегалозы из природных источников или за счет синтеза. Тем не менее, недавно был разработан эффективный ферментативный процесс для экономичного производства трегалозы из крахмала, которое стимулировало его широкое коммерческое использование ^5.

Химически модифицированные производные трегалозы, называемые здесь как аналоги трегалозу, приобрели все большее внимание для различных областей применения (общая структура , показанная на рисунке 1А; конкретные примеры аналогов трегалозных , показанных на рисунке 1В) ⁶, Например, лакто-трегалоза представляет собой трегалозу аналог с одним из ее звеньев глюкозы заменены галактозы, таким образом, его 4-положении гидроксильной группы имеет перевернутую стереохимическую конфигурацию. Лакто-трегалоза обладает теми же свойствами, что и стабилизирующие трегалозы , но устойчив к разложению под действием кишечных ферментов, что делает его привлекательным в качестве некалорийного пищевой добавки ^{6, 7.}

Интерес нашей группы в аналогах трегалозных прежде всего относится к их стоимости в качестве микобактерий специфических зондов и ингибиторов. Группы Барри и Дэвис разработал флуоресцеина-конъюгированные кето-трегалоза аналог, названный ФИТЦ-кето-трегалозы, который был показан на метаболически маркировать клеточную стенку живых микобактерий туберкулеза, что позволяет его обнаружение с помощью флуоресцентной микроскопии ^8. Лаборатория Bertozzi разработала меньший азидо-трегалозу (TreAz) аналоги, которые могут метаболически маркировать клеточную стенку, а затем быть Detected с использованием химических реактивов кнопкой мыши и флюоресцентного анализа ^9. Эти достижения указывают на возможность использования трегалозу на основе зондов в качестве диагностических средств формирования изображений для туберкулеза. Аналоги трегалозы также преследовало в качестве ингибиторов микобактерий туберкулеза из – за их потенциала для разрушения путей в бактерии , которые имеют важное значение для жизнеспособности и вирулентности ^{10, 11, 12.}

До сих пор главным препятствием на пути к разработке аналогов трегалозу для био (техно) логических и биомедицинских приложений является отсутствие эффективных методов синтеза. Две традиционные пути к производству аналогов трегалозу полагаются на химического синтеза (рисунок 2). Один маршрут включает в себя desymmetrization / модификации природных трегалозы, в то время как другая включает в себя, начиная с надлежащим образом функционализированных моносахарида строительных блоков и проведение химического гликозилирования кподделать 1,1-a, a-гликозидной связи. Эти подходы, которые недавно были обсуждены в обзорных статьях ^{13, 14,} оказались полезными для реализации многоступенчатый синтез небольших количеств сложных трегалозных содержащих натуральные продукты, такие как sulfolipid-1 от микобактерий туберкулеза ^15. Тем не менее, оба подхода, как правило, неэффективно, отнимает много времени, недоступных для не-химикам, и, кроме того, не считается экологически чистым. Таким образом, для синтеза некоторых типов трегалозных аналогов, эти стратегии не являются идеальными.

Рисунок 2: Подходы к трегалоза аналогового синтеза. Химические подходы к трегалоза аналогового синтеза, показанный на левой стороне, использовать многоэтапные процедуры, которые включают сложную ProtecТион / снятия защиты, desymmetrization, и / или гликозилирования шаги. Ферментативный синтез, показанный справа, использует фермент (ы) для стереоселективного преобразования простых, незащищенные субстратов трегалозных аналогов в водном растворе. Протокол ферментативный сообщаемые здесь используется трегалоза-синтазы (Tret) фермент для преобразования аналогов глюкозы и УДФ-глюкозы в аналоги трегалозных в одну стадию. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Эффективный биокаталитическая путь к трегалозных аналогам будет способствовать производству, оценки и применения этого перспективного класса молекул. В то время как коммерческий энзимный процесс для производства трегалозы ⁵ не адаптируется к синтезу аналогов , так как он использует крахмал в качестве субстрата, существуют другие биосинтетические путипути в природе, которые могут быть использованы злоумышленником для трегалозной аналогового синтеза. Тем не менее, исследования в этой области, который недавно был рассмотрен ^6, носит ограниченный характер . В одном из докладов был использован метод , вдохновленный кишечной палочки трегалозной пути биосинтеза доступ к одному Фтор-трегалоза аналог из соответствующего фтор-глюкозы. Тем не менее, этот подход требует системой трех фермента , который имеет ограниченную эффективность и общностью ^8. Другой подход , который был исследован, чтобы использовать трегалозу фосфорилазы (Trep) в обратном направлении, что , в принципе , позволяет одношагового синтеза аналогов трегалозных от аналогов глюкозы и глюкозо-1-фосфат ^{6, 16, 17.} Хотя такой подход может иметь будущее обещание, оба инвертирование и удерживающие TrePs в настоящее время имеют свои недостатки для аналогового синтеза. Например, обращающие TrePs имеют непомерно EXPEонительных молекула-донор (β-D-глюкоза-1-фосфата) и фиксирующее TrePs имеют плохой выход экспрессии фермента / стабильность и ограниченную распущенность субстрата. Значительные улучшения (например, посредством фермента инженерии) будут необходимы прежде , чем TREP-опосредованной аналогового синтеза является практичным.

В настоящее время наиболее практичным подходом для ферментативного синтеза аналогов трегалозных является использование трегалоза – синтазы (Tret) фермент, преобразующий глюкозу и уридин дифосфат (UDP) , -глюкозы в трегалозу в одном шаге ^6. Недавно мы сообщали об использовании Thermoproteus TENAX Tret-термостабильной и однонаправленной фермента ¹⁸ -в синтезировать аналоги трегалозу от аналогов глюкозы и UDP-глюкозы (Рисунок 3) ^19. Этот фермент действует только в синтетическом направлении и позволяет избежать проблемы деградации трегалозы, обнаруженных в системе Trep. Это одна стадия реакции Клd быть завершена в течение 1 часа, и широкое разнообразие аналогов трегалозных были доступны с высоким выходом (до> 99% , как определено с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)) из легко доступных аналоговых глюкозы подложках (см таблицу 1 в репрезентативных результатов раздел).

Рисунок 3: Tret катализируемой одностадийного синтеза аналогов трегалозных. Tret фермент из T. Tenax может стереоселективного присоединиться к легкодоступных аналоги глюкозы и УДФ-глюкозы с образованием аналогов трегалозы в одном шаге. R ¹ -R ⁴ = Переменный структурная модификация, например azido-, фтор-, дезокси-, тио-, стереохимическая или изотопных модификаций этикеток; Y = переменная гетероатом, например, кислород или серу, или меченные изотопами гетероатомом.

Здесь мы предоставляем объявлениеetailed протокол для процесса синтеза Tret, в том числе экспрессии и очистки Tret из E.coli, оптимизированные Tret условия проведения реакции, и усовершенствованный способ очистки , который осуществляют полностью в водной фазе. Этот модифицированный протокол позволяет целесообразный и эффективный синтез и очистку разнообразных аналогов трегалозных на полупрепаративной шкале (10-100 мг). Мы также продемонстрировать использование этого протокола для подготовки и введения трегалозу на основе зонда для микобактерий менее чем за 1 час, что позволило быстрое обнаружение флуоресценции клеток микобактерий.