Rápida em uma etapa enzimática Síntese e All-aquosa Purificação da trealose Análogos

A trealose é um dissacárido não redutor simétrico que consiste em duas metades de glicose que são unidas por uma 1,1-α, ligação α-glicosídica (Figura 1A). Enquanto trealose está ausente de seres humanos e outros mamíferos, ele é normalmente encontrada em bactérias, fungos, plantas e invertebrados ^1. O principal papel da trealose na maioria dos organismos é proteger contra stresses ambientais, tais como dessecação ^1. Além disso, alguns agentes patogénicos humanos exigir trealose para virulência, incluindo o Mycobacterium tuberculosis causadoras de tuberculose, a qual utiliza trealose como um mediador da biossíntese do envelope celular e como um bloco de construção para a construção de glicolípidos imunomoduladores ^2.

Figura 1: A trealose e análogos de trealose. (AEstruturas de trealose) natural e um análogo de trealose não natural, em que X é uma modificação estrutural. (B) Os exemplos de análogos de trealose relatados na literatura que têm aplicações potenciais em biopreservação e bioimaging.

Devido à sua estrutura única e as funções fisiológicas, trealose tem atraído uma atenção significativa para utilização em bio (tecno) lógica e aplicações biomédicas ^3. As propriedades de proteção de trealose observados na Natureza, por exemplo, a sua capacidade impressionante para ajudar a sustentar a vida em plantas "ressurreição" que foram submetidos a desidratação extrema ⁴ -ter estimulou sua ampla utilização em aplicações Bioconservação. A trealose foi utilizada para preservar uma grande variedade de amostras biológicas, tais como ácidos nucleicos, proteínas, células e tecidos ^3. Por exemplo, a trealose é utilizado como um aditivo estabilizante em um certo número de produtos farmacêuticos tchapéu estão no mercado, incluindo vários anticorpos monoclonais anti-câncer ^3. Assim, a trealose é utilizado como um adoçante na indústria alimentar e é amplamente utilizado para a conservação do produto em ambos os indústrias alimentar e cosmética. A adopção de trealose para estes tipos de aplicações comerciais foi inicialmente limitada pela incapacidade de obter grandes quantidades de trealose pura a partir de fontes naturais ou através de síntese. No entanto, um processo enzimático eficaz para a produção económica de trealose a partir de amido foi recentemente desenvolvido, que tem estimulado o seu uso comercial generalizado ^5.

Derivados de trealose, quimicamente modificada, aqui referidos como análogos de trealose, ganharam cada vez mais atenção para várias aplicações (estrutura genérica mostrada na Figura 1A; Exemplos específicos de análogos de trealose mostrados na Figura 1B) ⁶. Por exemplo, lacto-trealose é um análogo de trealose com uma das suas unidades de glucose substituída com galactose, assim, o seu grupo hidroxilo na posição 4 tem uma configuração estereoquímica invertida. Lacto-trealose tem as mesmas propriedades estabilizadores como trealose, mas é resistente à degradação por enzimas intestinais, tornando-o atractivo como um aditivo alimentar não calórico ^{6, 7.}

O interesse de nosso grupo no análogos trealose refere-se principalmente ao seu valor como sondas e inibidores específicos de micobactérias. Os grupos Barry e Davis desenvolvido um análogo ceto-trealose fluoresceína conjugado, com o nome de FITC-ceto-trealose, o que foi mostrado para metabolicamente rotular a parede celular de M. tuberculosis ao vivo, permitindo a sua detecção por microscopia de fluorescência ^8. O laboratório Bertozzi desenvolvido menor azido-trealose (TreAz) análogos que poderia metabolicamente rotular a parede celular e, subsequentemente, ser detected usando clique química e análise de fluorescência ^9. Estes avanços apontam para a possibilidade de utilização de sondas baseadas em trealose como agentes de imagiologia de diagnóstico para a tuberculose. Análogos trealose também têm sido perseguido como inibidores de M. tuberculosis devido ao seu potencial para perturbar percursos na bactéria que são essenciais para a viabilidade e virulência ^{de 10, 11, 12.}

Até agora, o principal obstáculo para o desenvolvimento de análogos de trealose para bio (tecno) aplicações lógicas e biomédicas é a falta de métodos sintéticos eficientes. As duas rotas tradicionais para a produção de análogos de trealose dependem de síntese química (Figura 2). Uma via envolve desymmetrization / alteração de trealose natural, enquanto a outra envolve começando com blocos de construção de monossacárido apropriadamente funcionalizadas e realizando a glicosilação químicaforjar a, ligação α-glicosídica 1,1-α. Estas abordagens, que foram recentemente discutidas em artigos de revisão ^{13, 14,} provaram ser úteis para realizar a síntese de várias etapas de pequenas quantidades de produtos naturais contendo trealose complexos, tais como sulfolipido-1 a partir de M. tuberculosis ^15. No entanto, ambas as abordagens são geralmente ineficientes, demorado, inacessível aos não-químicos, e, além disso, não são considerados como sendo amigos do ambiente. Assim, para a síntese de certos tipos de análogos de trealose, estas estratégias não são ideais.

Figura 2: Abordagens para a síntese de trealose analógico. Chemical abordagens para a síntese de trealose analógico, mostrada à esquerda, utilize os procedimentos de várias etapas que envolvem difícil protecpassos ção / desprotecção, desymmetrization, e / ou glicosilação. Síntese enzimática, mostrado no lado direito, utiliza enzima (s) para converter substratos estereosselectivamente simples, não protegida para trealose análogos em solução aquosa. O protocolo enzimática aqui relatada utiliza um enzima sintase de trealose (t Ret) para converter os análogos de glucose e UDP-glicose em análogos de trealose num único passo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma rota biocatalítico eficiente de análogos de trealose facilitaria a produção, avaliação e aplicação desta classe promissora de moléculas. Embora o processo enzimático comercial para a produção de trealose ⁵ não é adaptável para a síntese de análogos, porque utiliza o amido como um substrato, há outro caminho biossintéticoformas de arte na natureza que podem ser exploradas para a síntese analógica trealose. No entanto, a investigação nesta área, que foi recentemente revisto ^6, tem sido limitada. Um relatório usou um método inspirado na via biossintética trealose Escherichia coli para acessar um único analógico fluoro-trealose do flúor-glucose correspondente. No entanto, esta abordagem requer um sistema de três-enzima que tenha a eficiência e a generalidade ⁸ limitado. Outra abordagem que tem sido explorada é a utilização de trealose-fosforilase (TREP) no sentido inverso, o que, em princípio, permite a síntese de uma etapa de análogos de trealose a partir de análogos de glucose e ^{glucose-1-fosfato-6, 16, 17.} Embora esta abordagem pode ter promessa de futuro, ambos os inversores e reter TrePs atualmente têm desvantagens para a síntese analógica. Por exemplo, TrePs invertendo ter uma expe proibitivamentensive molécula de dador (β-D-glucose-1-fosfato) e TrePs de retenção têm rendimentos de expressão de enzima pobre / estabilidade e promiscuidade substrato limitada. Melhorias significativas (por exemplo, através de engenharia enzimática) serão necessários antes da síntese analógica TREP-mediada é prático.

Actualmente, a abordagem mais prática para a síntese enzimática de análogos de trealose é a utilização de uma enzima sintetase de trealose (t Ret), que converte a glicose e difosfato de uridina (UDP) -glucose em trealose num único passo ^6. Recentemente, relatou a utilização de Thermoproteus tenax-Tret uma enzima termoestável e unidireccional ¹⁸ -para sintetizar análogos de trealose a partir de análogos de glucose e UDP-glucose (Figura 3) ^19. Esta enzima funciona apenas no sentido sintético e evita o problema de degradação de trealose foi encontrado no sistema TREP. Este coul reacção de um passod ser completada em 1 hora, e uma ampla variedade de análogos de trealose foram acedidos com um rendimento elevado (até> 99% tal como determinado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)) a partir de substratos análogo da glicose prontamente disponíveis (ver Tabela 1 nos resultados representativos seção).

Figura 3: síntese de um só passo Tret-catalisada de análogos de trealose. A enzima Tret de T. tenax estereosselectivamente pode juntar-se análogos de glicose prontamente disponíveis e UDP-glicose para formar análogos de trealose em um passo. R ¹ -R ⁴ = modificação estrutural variável, por exemplo azido, fluoro, desoxi-, tio-, estereoquímica, ou modificações marcador isotópico; Y = heteroátomo variável, por exemplo oxigénio ou enxofre, ou heteroátomo marcado isotopicamente.

Aqui, nós fornecemos adProtocolo PORMENORIZADA para o processo de síntese Tret, incluindo a expressão e purificação de Tret partir de E. coli, as condições de reacção optimizado Tret, e um método de purificação melhorado, que é levada a cabo inteiramente na fase aquosa. Este protocolo modificado permite a síntese conveniente e eficiente e purificação de diversos análogos de trealose à escala semi-preparativa (10-100 mg). Nós também demonstrar o uso deste protocolo para preparar e administrar uma sonda à base de trealose a micobactérias em menos de 1 hora, o que permitiu a detecção de fluorescência rápida de células de micobactérias.