Rapid One-step enzimatica Sintesi e All-acquosa Purificazione di trealosio analoghi

Il trealosio è un disaccaride simmetrica non riducente consistente in due frazioni di glucosio che sono uniti da un 1,1-α, legame α-glicosidico (Figura 1A). Mentre trealosio è assente da esseri umani e altri mammiferi, si trova comunemente nei batteri, funghi, piante e invertebrati ^1. Il ruolo primario di trealosio in molti organismi a proteggere dagli stress ambientali, come essiccazione ^1. Inoltre, alcuni agenti patogeni umani richiedono trealosio per la virulenza, compresa la tubercolosi Mycobacterium tuberculosis causano, che utilizza trealosio come mediatore della biosintesi busta cellulare e come un blocco di costruzione per la costruzione di glicolipidi immunomodulanti ^2.

Figura 1: Il trealosio e analoghi trealosio. (A) Strutture di trealosio naturale e un analogo trealosio innaturale, dove X è una modifica strutturale. (B) Esempi di analoghi trealosio riportati in letteratura che hanno potenziali applicazioni in bioconservazione e bioimmagini.

Grazie alla sua struttura unica e funzioni fisiologiche, trealosio ha attirato grande attenzione per l'uso in bio (tecno) logici e applicazioni biomediche ^3. Le proprietà protettive del trealosio osservati in natura- ad esempio, la sua capacità sorprendente per contribuire a sostenere la vita delle piante "Resurrezione", che sono stati sottoposti a disidratazione estrema ⁴ -hanno spronato il suo ampio uso in applicazioni bioconservazione. Trealosio è stato usato per conservare una vasta gamma di campioni biologici, come acidi nucleici, proteine, cellule e tessuti ^3. Per esempio, trealosio viene utilizzato come additivo stabilizzante in un certo numero di prodotti farmaceutici tcappello sono sul mercato, tra cui diversi anticorpi monoclonali anti-cancro ^3. Così, trealosio viene utilizzato come dolcificante nell'industria alimentare, ed è ampiamente usato per la conservazione del prodotto sia nell'industria alimentare e cosmetica. L'adozione di trealosio per questi tipi di applicazioni commerciali è stata inizialmente limitata dalla incapacità di ottenere grosse quantità di trealosio puro da fonti naturali o attraverso la sintesi. Tuttavia, è stato recentemente sviluppato un processo enzimatico efficiente per la produzione economica di trealosio da amido, che ha stimolato l'uso commerciale diffuso ^5.

Derivati di trealosio chimicamente modificato, qui denominati analoghi trealosio, hanno guadagnato crescente attenzione per varie applicazioni (struttura generica mostrata in figura 1A, esempi specifici di analoghi trealosio illustrati nella Figura 1B) ⁶. Ad esempio, lacto-trealosio è un analogo trealosio con una sua unità di glucosio sostituito con galattosio, quindi il suo gruppo ossidrilico posizione 4 ha una configurazione stereochimica invertita. Lacto-trealosio ha le stesse proprietà stabilizzanti come trealosio, ma è resistente alla degradazione da parte degli enzimi intestinali, rendendolo attraente come un non-calorico additivo alimentare ^{6, 7.}

l'interesse del nostro gruppo in analoghi trealosio si riferisce in primo luogo al loro valore come sonde e gli inibitori specifici per micobatteri. I gruppi di Barry e Davis hanno sviluppato un cheto-trealosio analogico fluoresceina coniugato, chiamato FITC-cheto-trealosio, che è stato mostrato al metabolicamente etichettare la parete cellulare di vivere M. tuberculosis, che consente il rilevamento da microscopia a fluorescenza ^8. Il laboratorio Bertozzi sviluppato più piccolo azido-trealosio (TreAz) analoghi che potrebbero metabolicamente etichetta la parete cellulare e, successivamente, essere detette utilizzando clic chimica e analisi di fluorescenza ^9. Questi progressi indicano la possibilità di utilizzare sonde trealosio-based come agenti di imaging diagnostico per la tubercolosi. Analoghi trealosio sono stati perseguiti come inibitori di M. tuberculosis a causa del loro potenziale di distruggere percorsi nel batterio che sono essenziali per la vitalità e la virulenza ^{10, 11, 12.}

Finora, il principale ostacolo allo sviluppo di analoghi trealosio per bio (tecno) applicazioni logiche e biomediche è la mancanza di metodi di sintesi efficienti. I due percorsi tradizionali per produrre analoghi trealosio basano sulla sintesi chimica (Figura 2). Un percorso coinvolge desymmetrization / modifica di trealosio naturale, mentre l'altro comporta iniziano adeguatamente funzionalizzati blocchi monosaccaridi ed eseguendo glicosilazione chimicoforgiare la 1,1-α, legame α-glicosidico. Questi approcci, che sono stati recentemente discussi in articoli di revisione ^{13, 14,} si sono dimostrati utili per compiere sintesi multistadio di piccole quantità di prodotti naturali trealosio contenenti complessi, come sulfolipid-1 da M. tuberculosis ^15. Tuttavia, entrambi gli approcci sono generalmente inefficienti, tempo, inaccessibili ai non chimici, e, inoltre, non sono considerati essere rispettosi dell'ambiente. Così, per sintetizzare alcuni tipi di analoghi trealosio, queste strategie non sono ideali.

Figura 2: Approcci alla sintesi trealosio analogico. Chimica si avvicina alla sintesi trealosio analogico, mostrato a sinistra, utilizzare le procedure più fasi che coinvolgono Protec difficilepassi zione / deprotezione, desymmetrization, e / o glicosilazione. sintesi enzimatica, mostrata a destra, usa enzima (s) per convertire stereoselettiva semplici, substrati non protetti trealosio analoghi in soluzione acquosa. Il protocollo enzimatica qui riportate utilizza un enzima trealosio sintasi (Tret) per convertire analoghi di glucosio e UDP-glucosio in analoghi trealosio in un unico passaggio. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Un efficiente percorso biocatalitico agli analoghi trealosio faciliterebbe la produzione, la valutazione e l'applicazione di questa promettente classe di molecole. Mentre il processo enzimatico commerciale per la produzione di trealosio ⁵ non è adattabile a sintetizzare analoghi perché utilizza amido come substrato, ci sono altri percorso biosinteticomodi in natura che possono essere utilizzate per la sintesi analogica trealosio. Tuttavia, la ricerca in questo settore, che è stato recentemente rivisto ^6, è stato limitato. Un rapporto ha usato un metodo ispirato al coli trealosio via biosintetica Escherichia per accedere a un singolo analogico fluoro-trealosio dal corrispondente fluoro-glucosio. Tuttavia, questo approccio richiede un sistema a tre enzima che ha limitato l'efficienza e generalità ^8. Un altro approccio che è stato esplorato è usare trealosio fosforilasi (TRTP) in senso inverso, che in linea permette la sintesi one-step di analoghi trealosio da analoghi di glucosio e di glucosio-1-fosfato ^{6, 16, 17.} Anche se questo approccio può avere promessa futura, sia invertenti e trattenere i TREP attualmente hanno svantaggi per la sintesi analogica. Ad esempio, i TREP inversione hanno un espe proibitivomolecola nsive donatore (β-D-glucosio 1-fosfato) e TREP ritegno hanno scarsa resa di espressione dell'enzima / stabilità e limitato la promiscuità substrato. Saranno necessari miglioramenti significativi (ad esempio, attraverso l'ingegneria enzima) prima di sintesi analogica TREP-mediata è pratico.

Allo stato attuale, l'approccio più pratico per la sintesi enzimatica di analoghi trealosio è usare un enzima trealosio sintasi (TRET), che converte il glucosio e uridina difosfato (UDP) Glucosio in trealosio in un unico passaggio ^6. Recentemente abbiamo segnalato l'uso di Thermoproteus tenax Tret-un enzima termostabile e unidirezionale ¹⁸ -per sintetizzare analoghi trealosio da analoghi di glucosio e UDP-glucosio (Figura 3) ^19. Questo enzima agisce solo nella direzione sintetica ed evita il problema del degrado trealosio trova nel sistema TREP. Questa reazione coul one-stepd essere completato in 1 ora, e una vasta gamma di analoghi trealosio sono stati accessibile in alto rendimento (fino a> 99% come determinato da alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC)) da substrati analogo del glucosio prontamente disponibili (vedi tabella 1 nelle Rappresentante dei risultati sezione).

Figura 3: Tret-catalizzata sintesi one-step di analoghi trealosio. L'enzima Tret da T. tenax può stereoselettiva unirsi analoghi di glucosio prontamente disponibili e UDP-glucosio per formare analoghi trealosio in un unico passaggio. R ¹ -R ⁴ = Variabile modifica strutturale, per esempio azido-, fluoro-, deoxy-, thio-, stereochimica, o modifiche di etichette isotopici; Y = eteroatomo variabile, ad esempio ossigeno o zolfo, o eteroatomo marcati con isotopi.

Qui, forniamo annuncioprotocollo Nell'odontoiatria per il processo di sintesi TRET, compresa l'espressione e la purificazione di Tret da E. coli, ottimizzato condizioni di reazione TRET, ed un metodo di purificazione perfezionato che viene eseguita interamente in fase acquosa. Questo protocollo modificato consente la sintesi opportuno ed efficiente e purificazione di diversi analoghi trealosio su scala semi-preparativa (10-100 mg). Dimostriamo anche l'uso di questo protocollo per la preparazione e la somministrazione di una sonda trealosio-based per micobatteri in meno di 1 ora, che ha permesso la rilevazione di fluorescenza rapida delle cellule micobatteri.