Rapid One-step Synthèse enzymatique et All-aqueuse Purification de tréhalose Analogues

Trehalose est un disaccharide symétrique non réducteur consistant en deux fractions de glucose qui sont liés par un 1,1-α, une liaison α-glycosidique (figure 1A). Alors que le tréhalose est absent de l' homme et d' autres mammifères, on trouve communément dans les bactéries, les champignons, les plantes et les invertébrés ^1. Le rôle principal de tréhalose dans la plupart des organismes est de protéger contre les contraintes environnementales, telles que la dessiccation ^1. En outre, certains agents pathogènes humains exigent tréhalose pour la virulence, y compris le Mycobacterium tuberculosis tuberculosis causant, qui utilise le tréhalose en tant que médiateur de l' enveloppe cellulaire biosynthèse et comme un bloc de construction pour la construction de glycolipides immunomodulateurs ^2.

Figure 1: tréhalose et analogues tréhalose. (ALes structures de tréhalose) naturel et un analogue de tréhalose non naturel, où X est une modification structurelle. (B) Des exemples d'analogues de tréhalose dans la littérature qui ont des applications potentielles en imagerie biologique et biopréservation.

En raison de sa structure unique et les fonctions physiologiques, tréhalose a attiré beaucoup d' attention pour une utilisation en bio (techno) logique et applications biomédicales ^3. Les propriétés protectrices du tréhalose observée dans nature- par exemple, sa capacité de frappe pour aider à maintenir la vie dans les plantes "résurrection" qui ont subi une déshydratation extrême ⁴ -avoir stimulé son utilisation intensive dans des applications de biopréservation. Tréhalose a été utilisé pour conserver une grande variété d'échantillons biologiques, tels que des acides nucléiques, des protéines, des cellules, des tissus et ^3. Par exemple, le tréhalose est utilisé comme additif stabilisant dans un certain nombre de produits pharmaceutiques tchapeau sont sur le marché, y compris plusieurs anticorps monoclonaux anti-cancer ^3. De plus, le tréhalose est utilisé comme édulcorant dans l'industrie alimentaire, et il est largement utilisé pour la conservation des produits dans les deux industries alimentaires et cosmétiques. L'adoption de tréhalose pour ces types d'applications commerciales était initialement limitée par l'impossibilité d'obtenir des quantités en vrac de tréhalose pur à partir de sources naturelles ou par synthèse. Cependant, un procédé enzymatique efficace pour la production économique de tréhalose à partir d'amidon a été récemment mis au point, ce qui a stimulé son utilisation commerciale à grande échelle ^5.

Les dérivés de tréhalose chimiquement modifié, désigné ici comme analogues de tréhalose, ont acquis un intérêt croissant pour des applications diverses (structure générale représentée sur la figure 1A, des exemples spécifiques d'analogues de trehalose représentées sur la figure 1B) ⁶. Par exemple, le lacto-tréhalose est un analogue de tréhalose avec l'une de ses unités de glucose remplacé par le galactose, donc son groupe hydroxyle en position 4 a une configuration stéréochimique inversée. Lacto-tréhalose a les mêmes propriétés stabilisantes que le trehalose mais résiste à la dégradation par les enzymes intestinales, ce qui rend attrayant comme additif alimentaire non calorique ^{6, 7.}

L'intérêt de notre groupe dans les analogues de tréhalose est principalement liée à leur valeur en tant que sondes et des inhibiteurs spécifiques de mycobactéries. Les groupes Barry et Davis ont développé un céto-analogue de tréhalose conjugué à la fluorescéine, du nom FITC-céto-tréhalose, qui a été montré pour étiqueter métaboliquement la paroi cellulaire de M. tuberculosis en temps réel, permettant sa détection par microscopie à fluorescence à ^8. Le laboratoire Bertozzi développé plus petit azido-tréhalose (TreAz) analogues qui pourraient métaboliquement étiqueter la paroi cellulaire et ensuite être detète utilisant clic chimie et analyse de fluorescence ^9. Ces progrès indiquent la possibilité d'utiliser des sondes à base de trehalose comme agents d'imagerie de diagnostic de la tuberculose. Analogues de tréhalose ont également été poursuivis comme inhibiteurs de M. tuberculosis en raison de leur potentiel de perturber les voies de la bactérie qui sont essentiels pour la viabilité et la virulence ^{10, 11, 12.}

Jusqu'à présent, le principal obstacle au développement des analogues de tréhalose pour les bio (techno) applications logiques et biomédicales est le manque de méthodes de synthèse efficaces. Les deux voies traditionnelles de la production d' analogues de tréhalose reposent sur la synthèse chimique (figure 2). Une voie consiste désymétrisation / modification du tréhalose naturel, tandis que l'autre consiste à commencer par convenablement fonctionnalisés, des blocs de construction monosaccharides et à effectuer la glycosylation chimiqueforger le 1,1-α, liaison α-glycosidique. Ces approches, qui ont été récemment abordés dans les articles de revue ^{13, 14,} se sont avérées utiles pour accomplir la synthèse multi – étapes de petites quantités de produits naturels complexes contenant du tréhalose, tels que sulfolipide-1 de M. tuberculosis ^15. Cependant, les deux approches sont généralement inefficaces, de temps, inaccessible aux non-chimistes, et, en outre, ne sont pas considérés comme respectueux de l'environnement. Ainsi, pour la synthèse de certains types d'analogues de trehalose, ces stratégies ne sont pas idéales.

Figure 2: Approches à la synthèse du tréhalose analogique. approches chimiques pour la synthèse du tréhalose analogique, montré sur la gauche, utiliser les procédures qui impliquent plusieurs étapes protec difficiletion étapes / déprotection, Desymmetrization et / ou glycosylation. Synthèse enzymatique, illustré à droite, utilise une enzyme (s) pour convertir stéréosélectivement substrats simples, non protégés à trehalose analogues en solution aqueuse. Le protocole enzymatique rapportée ici utilise une enzyme tréhalose synthase (TRET) pour convertir le glucose et les analogues de l'UDP-glucose dans les analogues de tréhalose en une seule étape. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Une biocatalytique voie efficace aux analogues tréhalose faciliterait la production, l'évaluation et l'application de cette classe prometteuse de molécules. Bien que le procédé enzymatique commerciale pour la production de tréhalose ⁵ ne sont pas adaptables à la synthèse des analogues car il utilise l' amidon comme substrat, il existe un autre chemin biosynthétiquedes moyens dans la nature qui peuvent être exploitées pour la synthèse de l'analogue de tréhalose. Cependant, la recherche dans ce domaine, qui a été récemment examiné ^6, a été limitée. Un rapport a utilisé une méthode inspirée de la voie de biosynthèse du trehalose Escherichia coli pour accéder à un analogue de la fluoro-tréhalose à partir du fluoro-glucose correspondante. Cependant, cette approche nécessite un système à trois enzymes qui a l' efficacité et de la généralité ⁸ limitée. Une autre approche a été explorée consiste à utiliser tréhalose – phosphorylase (PRT) dans le sens inverse, ce qui permet , en principe , la synthèse une étape d'analogues de tréhalose à partir d' analogues de glucose et de glucose-1-phosphate de ^{6, 16, 17.} Bien que cette approche peut avoir un avenir prometteur, les deux TREPS inverseurs et de retenue ont actuellement des inconvénients pour la synthèse analogique. Par exemple, TREPS inverseurs ont une expé prohibitifnsive molécule donneuse (β-D-glucose-1-phosphate) et TREPS de retenue ont une faible rendement d'expression d'une enzyme / stabilité et la promiscuité de substrat limitée. Des améliorations significatives (par exemple, par l' intermédiaire de l' ingénierie enzymatique) seront nécessaires avant que la synthèse analogique TREP-médiée est pratique.

À l' heure actuelle, l'approche la plus pratique pour la synthèse enzymatique des analogues de tréhalose est d'utiliser une tréhalose synthase (TRET) une enzyme qui convertit le glucose et l' uridine diphosphate (UDP) Glucose dans le tréhalose en une seule étape ^6. Nous avons récemment rapporté l'utilisation de Thermoproteus tenax Tret-une enzyme thermostable et unidirectionnel ¹⁸ -à synthétiser des analogues de tréhalose des analogues de glucose et UDP-glucose (Figure 3) ^19. Cette enzyme ne fonctionne que dans le sens synthétique et évite le problème de la dégradation de la tréhalose trouve dans le système PRT. Cette réaction coul en une étaped être achevée en 1 heure, et une grande variété d'analogues de tréhalose ont été consultées avec un rendement élevé (jusqu'à> 99% telle que déterminée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC)) à partir de facilement disponibles substrats analogues de glucose (voir le tableau 1 dans les résultats représentatifs section).

Figure 3: Tret-synthèse catalysée par une étape d'analogues de tréhalose. TRET l'enzyme de T. tenax peut se joindre stéréosélectivement facilement disponibles analogues du glucose et UDP-glucose pour former des analogues de tréhalose en une seule étape. R ¹ -R ⁴ = modification structurelle variable, par exemple azido-, fluoro-, désoxy-, thio-, stéréochimique ou modifications d'étiquettes isotopiques; Y = hétéroatome variable, par exemple de l'oxygène ou du soufre, ou un hétéroatome isotope.

Ici, nous fournissons adetailed protocole pour le procédé de synthèse TRET, y compris l' expression et la purification de TRET de E. coli, optimisé les conditions de réaction TRET et un procédé amélioré de purification qui est réalisée entièrement dans la phase aqueuse. Ce protocole modifié permet la synthèse et la purification rapide et efficace des analogues de tréhalose diverses sur une échelle semi-préparative (10-100 mg). Nous démontrons également l'utilisation de ce protocole pour la préparation et l'administration d'une sonde à base de trehalose à mycobactéries en moins de 1 heure, ce qui a permis la détection de fluorescence rapide des cellules mycobactériennes.