Rapid One-step enzymatische synthese en All-waterige Zuivering van Trehalose analogen

Trehalose is een symmetrische niet-reducerende disaccharide bestaande uit twee glucose eenheden die zijn verbonden door een 1,1-α, α-glycosidische binding (Figuur 1A). Terwijl trehalose ontbreekt in mensen en andere zoogdieren wordt aangetroffen bij bacteriën, schimmels, planten en invertebraten ^1. De primaire rol van trehalose in de meeste organismen te beschermen tegen milieu-invloeden, zoals uitdroging ^1. Bovendien hebben sommige humane pathogenen vereist trehalose voor virulentie, waaronder tuberculose veroorzaakt Mycobacterium tuberculosis, die trehalose gebruikt als een mediator van celwand biosynthese en als bouwsteen voor de constructie van immunomodulerende glycolipiden ^2.

Figuur 1: Trehalose en trehalose analogen. (A) Structuren van trehalose natuurlijke en onnatuurlijke analoge trehalose, waarbij X een structurele modificatie. (B) Voorbeelden van trehalose analogen in de literatuur dat potentiële toepassingen in biopreservation en Bio-imaging hebben.

Door zijn unieke structuur en fysiologische functies, heeft trehalose veel aandacht getrokken voor gebruik in bio (techno) logisch en biomedische toepassingen ^3. De beschermende eigenschappen van trehalose waargenomen in natuur- bv, zijn opvallende vermogen om te helpen ondersteunen het leven in 'opstanding' planten die extreme uitdroging hebben ondergaan ⁴ -hebben spoorde haar uitgebreide gebruik in biopreservation toepassingen. Trehalose is gebruikt voor een breed scala aan biologische monsters, zoals nucleïnezuren, eiwitten, cellen en weefsels ³ behouden. Zo wordt trehalose gebruikt als stabiliserende additief in een aantal farmaceutische thoed op de markt, waaronder een aantal anti-kanker monoklonale antilichamen ^3. Eveneens, wordt trehalose gebruikt als zoetstof in de voedingsindustrie, en het wordt uitgebreid voor product bewaren voor voedsel en cosmetische industrie. De vaststelling van trehalose voor deze soorten commerciële toepassingen werd aanvankelijk beperkt door het onvermogen om grote hoeveelheden zuiver trehalose uit natuurlijke bronnen of door middel van synthese te verkrijgen. Echter, een efficiënte enzymatische werkwijze voor de economische productie van trehalose uit zetmeel is recent ontwikkeld, die het wijdverbreide commerciële toepassing heeft aangezet ^5.

Chemisch gemodificeerde derivaten van trehalose, hierin aangeduid als trehalose analogen steeds meer aandacht hebben gekregen voor verschillende toepassingen (algemene structuur in figuur 1A, specifieke voorbeelden van trehalose analogen figuur 1B) ⁶. Bijvoorbeeld, Lacto-trehalose is trehalose analoog met één van de glucose-eenheden vervangen galactose, waardoor de 4-positie hydroxylgroep een omgekeerde stereochemische configuratie. Lacto-trehalose heeft dezelfde eigenschappen als stabiliserende trehalose maar is resistent tegen afbraak door intestinale enzymen, waardoor zowel als niet-calorische additief ^{6, 7.}

het belang van onze fractie in trehalose-analogen in de eerste plaats betrekking heeft op hun waarde als mycobacteriën-specifieke probes en remmers. Barry en Davis groepen ontwikkelde een fluoresceïne-geconjugeerd keto-analoog trehalose, genaamd FITC-keto-trehalose, die bleek metabolisch labelen de celwand van levende M. tuberculosis, waardoor de detectie met fluorescentiemicroscopie ^8. De Bertozzi lab ontwikkelde kleinere azido-trehalose (TreAz) analogen die metabolisch kon het etiket van de celwand en vervolgens zijn detweerspiegelde het gebruik van click chemie en fluorescentie analyse ^9. Deze ontwikkelingen wijzen op de mogelijkheid van het gebruik van trehalose probes als diagnostische beeldvormingsmiddelen voor tuberculose. Trehalose analogen zijn ook gevoerd als remmers van M. tuberculosis wegens het potentiële trajecten in de bacterie die essentieel zijn voor de levensvatbaarheid en de virulentie ^{10, 11, 12} zijn verstoren.

Tot nu toe, het belangrijkste obstakel voor de ontwikkeling van trehalose analogen voor bio (techno) logisch en biomedische toepassingen is het gebrek aan efficiënte synthetische methoden. De twee traditionele routes te produceren trehalose analogen afhankelijk chemische synthese (Figuur 2). Één route omvat desymmetrization / modificatie van natuurlijke trehalose, terwijl de andere gaat ab goed gefunctionaliseerde monosaccharide bouwblokken en het uitvoeren van chemische glycosylering tesmeden de 1,1-α, α-glycosidische binding. Deze benaderingen, die onlangs in review artikelen ^{13, 14} hebben besproken, zijn nuttig voor het uitvoeren van meerdere stappen synthese van kleine hoeveelheden complexe-trehalose bevattende natuurlijke producten, zoals sulfolipid-1 van M. tuberculosis ¹⁵ bewezen. Is de benadering die in het algemeen inefficiënt, tijdrovend, ontoegankelijk voor niet-chemici en, bovendien, niet als milieuvriendelijk. Zo synthetiseren van bepaalde trehalose analogen, deze strategieën zijn niet ideaal.

Figuur 2: Benaderingen trehalose analoge synthese. Chemical zal trehalose analoge synthese, getoond aan de linkerkant, gebruiken meerdere stappen procedures die moeilijk bescherming te betrekkentie / ontscherming, desymmetrization en / of glycosylatie stappen. Enzymatische synthese, zie rechts, gebruikt enzym (en) stereoselectief omzetten eenvoudige onbeschermde substraten analogen in waterige oplossing trehalose. De enzymatische protocol dit formulier gebruikt een trehalose synthase (TRUE) enzym glucose analogen en UDP-glucose omzetten in trehalose analogen in een enkele stap. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een efficiënte biokatalytische route naar trehalose analogen zou de productie, evaluatie, en de toepassing van deze veelbelovende klasse van moleculen te vergemakkelijken. Terwijl de commerciële enzymatische werkwijze voor de productie van trehalose ⁵ is niet aangepast aan het synthetiseren van analogen omdat het gebruik maakt van zetmeel als substraat, zijn er andere biosynthetische padwijze natuur waarvan gebruik wordt gemaakt voor trehalose analoge synthese. Echter, onderzoek op dit gebied, die onlangs werd beoordeeld ^6, is beperkt. Eén melding gebruikte werkwijze geïnspireerd door Escherichia coli trehalose biosynthese route om een fluor-analoog trehalose uit de overeenkomstige fluor-glucose. Deze benadering vereist een drie-enzymsysteem dat beperkte efficiëntie en algemeenheid ^8. Een andere benadering die is onderzocht is trehalose fosforylase (TREP) gebruik in de omgekeerde richting, die in principe één-stap synthese van trehalose analogen van glucose analogen en glucose-1-fosfaat ^{6, 16, 17} mogelijk maakt. Hoewel deze aanpak belofte voor de toekomst kan hebben, zowel omkeren en behouden TREP hebben momenteel nadelen voor analoge synthese. Bijvoorbeeld, het omkeren van TREP een onbetaalbaar ervansive donormolecuul (β-D-glucose 1-fosfaat) en behouden TREP slechte enzymexpressie opbrengsten / stabiliteit en beperkte substraat promiscuïteit. Significante verbeteringen (bijvoorbeeld via enzyme engineering) nodig zal zijn voordat TREP-gemedieerde analoge synthese is praktisch.

Momenteel is de meest praktische benadering voor de enzymatische synthese van trehalose analogen is een trehalose synthase (Tret) enzym dat glucose omzet en uridine difosfaat (UDP) glucose in trehalose in een enkele stap ⁶ gebruikt. We hebben onlangs gemeld het gebruik van Thermoproteus tenax Tret-een thermostabiel enzym en unidirectionele ¹⁸ -de trehalose synthetiseren analogen van glucose analogen en UDP-glucose (figuur 3) ^19. Dit enzym werkt alleen in de richting synthetische en vermijdt het probleem van trehalose afbraak in het TREP systeem. Deze éénfasige reactie could vullen in 1 uur, en een grote verscheidenheid aan trehalose analogen werden benaderd in hoge opbrengst (tot> 99% zoals bepaald door hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC)) uit gemakkelijk beschikbare glucose analoge substraten (zie tabel 1 in de Representatieve resultaten sectie).

Figuur 3: TRet gekatalyseerde één-stap synthese van trehalose analogen. De Tret enzym uit T. tenax stereoselectief kan deelnemen beschikbaar glucose analogen en UDP-glucose trehalose analogen vormen in één stap. ^R1-R4 = Variable structurele modificatie, bijvoorbeeld azido-, fluor, deoxy-, thio-, stereochemische of isotoop label wijzigingen; Y = variabele heteroatoom, zoals zuurstof of zwavel, of een isotoop gemerkte heteroatoom.

Hier bieden we adEDETAILLEERDE protocol voor de Tret synthesewerkwijze, waaronder expressie en zuivering van Tret van E. coli geoptimaliseerde Tret reactieomstandigheden en een verbeterde zuiveringswerkwijze die volledig in de waterfase wordt uitgevoerd. Deze gewijzigde protocol kan de doelmatige en efficiënte synthese en zuivering van diverse analogen trehalose op semi-preparatieve schaal (10-100 mg). We tonen ook het gebruik van dit protocol voor het bereiden en toedienen van een trehalose-gebaseerde probe voor mycobacteriën in minder dan 1 uur, waarbij de snelle fluorescentie detectie van mycobacteriële cellen mogelijk.